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Tecnica di polimorfismo di lunghezza di frammento (RFLP) di restrizione

Il polimorfismo di lunghezza di frammento di restrizione (RFLP) è una tecnica inventata nel 1984 dallo scienziato inglese Alec Jeffreys durante la ricerca sulle malattie ereditarie. È utilizzato per l'analisi dei reticoli unici nelle sequenze di DNA per geneticamente differenziarsi fra gli organismi - questi reticoli sono chiamati Variable Number delle ripetizioni in tandem (VNTRs).

Il polimorfismo genetico è definito come le differenze genetiche ereditate fra le persone dentro più di 1% di popolazione normale. La tecnica del RFLP sfrutta queste differenze nelle sequenze del DNA per riconoscere e studiare sia la variazione intraspecies che interspecies.

Polimorfismo di lunghezza di frammento di restrizione
Polimorfismo di lunghezza di frammento di restrizione (RFLP)

Principio

Gli endonucleasi della restrizione sono enzimi che tagliano il lungo DNA in brevi pezzi. Ogni endonucleasi della restrizione mira alle sequenze di nucleotide differenti in un filo del DNA e quindi taglia ai siti differenti.

La distanza fra i siti di fenditura di determinato endonucleasi della restrizione differisce fra le persone. Quindi, la lunghezza delle sequenze di DNA prodotte da un endonucleasi della restrizione differirà attraverso entrambi gli diversi organismi e specie.

Come funziona?

Il RFLP è eseguito facendo uso di una serie di punti brevemente descritti qui sotto:

Estrazione del DNA

Per cominciare con, il DNA è estratto da sangue, dalla saliva o da altri campioni ed è depurato.

Frammentazione del DNA

Il DNA depurativo si digerisce facendo uso degli endonucleasi della restrizione. I siti di riconoscimento di questi enzimi sono generalmente 4 - 6 coppie di basi di lunghezza. Più breve la sequenza riconosciuta, maggior il numero dei frammenti generati da digestione.

Per esempio, se c'è una breve sequenza di GAGC che si presenta ripetutamente in un campione di DNA. L'endonucleasi della restrizione che riconosce la sequenza di GAGC taglia il DNA ad ogni ripetizione del reticolo di GAGC.

Se un campione ripete la sequenza di GAGC 4 volte mentre un altro campione la ripete 2 volte, la lunghezza dei frammenti generati dall'enzima per i due campioni sarà differente.

Elettroforesi del gel

I frammenti della restrizione prodotti durante la frammentazione del DNA sono analizzati facendo uso dell'elettroforesi del gel.

I frammenti sono negativamente - fatto pagare e possono essere separati facilmente tramite l'elettroforesi, che separa le molecole basate sulla loro dimensione e tassa. I campioni spezzettati del DNA sono collocati nella camera che contiene il gel elettroforetico e due elettrodi.

Quando un campo elettrico è applicato, i frammenti migrano verso l'elettrodo positivo. I più piccoli frammenti si muovono più velocemente attraverso il gel che lascia quei più grandi dietro ed i campioni del DNA sono separati così nelle bande distinte sul gel.

Visualizzazione delle bande

Il gel è trattato con le tinture luminescenti per rendere le bande del DNA visibili.

Applicazioni del RFLP

Il RFLP è stato usato per parecchie applicazioni genetiche dell'analisi dalla sua invenzione.

Alcuni di questi impostano le applicazioni del RFLP sono elencati qui sotto:

  • per determinare lo stato delle malattie genetiche quale fibrosi cistica in una persona.
  • per determinare o confermare la sorgente di un campione del DNA quali nelle prove o le indagini penali di paternità.
  • Nella mappatura genetica per determinare le tariffe di ricombinazione che mostrano la distanza genetica fra i luoghi.
  • per identificare i portafili di una mutazione malattia-causante in una famiglia.

Svantaggi del RFLP

Dalla sua invenzione, il RFLP è stato tecniche ampiamente usate di un'analisi del genoma impiegate nella scienza legale, nella medicina e negli studi genetici. Tuttavia, è diventato quasi obsoleto con l'arrivo di DNA relativamente semplice e meno costoso che profila le tecnologie quale la reazione a catena della polimerasi (PCR).

La procedura del RFLP richiede i numerosi punti e richiede le settimane ai risultati del rendimento, mentre le tecniche quale la PCR possono ampliare le sequenze del DNA dell'obiettivo in un mero poche ore.

Ulteriormente, il RFLP richiede un grande campione del DNA, l'isolamento di cui può essere un trattamento laborioso e che richiede tempo. Al contrario, la PCR può ampliare gli importi minuscoli di DNA nel giro di poche ore.

dovuto le numerose ragioni come questi, la tecnica di PCR in gran parte ha sostituito il RFLP nella maggior parte delle applicazioni che richiedono il DNA che ordina quali la prova di paternità o l'analisi legale del campione.

Ancora, l'identificazione dei polimorfismi del unico nucleotide nel progetto Genoma Umano quasi ha sostituito l'esigenza del RFLP nell'analisi di stato di malattia.

Riferimenti

Further Reading

Last Updated: Jun 26, 2019

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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    Cheriyedath, Susha. (2019, June 26). Tecnica di polimorfismo di lunghezza di frammento (RFLP) di restrizione. News-Medical. Retrieved on May 09, 2021 from https://www.news-medical.net/life-sciences/Restriction-Fragment-Length-Polymorphism-(RFLP)-Technique.aspx.

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Comments

  1. Rachael Bartram Rachael Bartram Australia says:

    when saying "For example, if there is a short sequence of GAGC that occurs repeatedly in a sample of DNA. The restriction endonuclease that recognizes the GAGC sequence cuts the DNA at every repetition of the GAGC pattern." what is GAGC?

  2. Satyajeet Khare Satyajeet Khare India says:

    I see a 1980 paper Botstein et al, AJMG which mentions RFLP.

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