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Técnica do polimorfismo de comprimento de fragmento (RFLP) de limitação

O polimorfismo de comprimento de fragmento de limitação (RFLP) é uma técnica inventada em 1984 pelo cientista inglês Alec Jeffreys durante a pesquisa em doenças hereditárias. É usado para a análise de testes padrões originais no ADN fragmenta a fim diferenciar-se genetically entre organismos - estes testes padrões são chamados Variável Número de repetições em tandem (VNTRs).

O polimorfismo genético é definido como as diferenças genéticas herdadas entre indivíduos dentro sobre 1% da população normal. A técnica do RFLP explora estas diferenças em seqüências do ADN para reconhecer e estudar a variação intraspecies e interspecies.

Polimorfismo de comprimento de fragmento de limitação
Polimorfismo de comprimento de fragmento de limitação (RFLP)

Princípio

Os endonucleases da limitação são as enzimas que cortam o ADN longo em partes curtos. Cada endonuclease da limitação visa seqüências de nucleotide diferentes em uma costa do ADN e corta-as conseqüentemente em locais diferentes.

A distância entre os locais da segmentação de um determinado endonuclease da limitação difere entre indivíduos. Daqui, o comprimento dos fragmentos do ADN produzidos por um endonuclease da limitação diferirá através de ambos os organismos e espécies individuais.

Como trabalha?

O RFLP é executado usando-se uma série de etapas esboçadas momentaneamente abaixo:

Extracção do ADN

Para começar com, o ADN é extraído do sangue, da saliva ou das outras amostras e refinado.

Fragmentação do ADN

O ADN refinado é digerido usando endonucleases da limitação. Os locais de reconhecimento destas enzimas são geralmente 4 a 6 pares baixos de comprimento. Mais curto a seqüência reconhecida, maior o número de fragmentos gerados da digestão.

Por exemplo, se há uma seqüência curto de GAGC que ocorre repetidamente em uma amostra de ADN. O endonuclease da limitação que reconhece a seqüência de GAGC corta o ADN em cada repetição do teste padrão de GAGC.

Se uma amostra repete a seqüência de GAGC 4 vezes enquanto uma outra amostra a repete 2 vezes, o comprimento dos fragmentos gerados pela enzima para as duas amostras será diferente.

Electroforese do gel

Os fragmentos da limitação produzidos durante a fragmentação do ADN são analisados usando a electroforese do gel.

Os fragmentos são negativamente - cobrado e podem facilmente ser separados pela electroforese, que separa as moléculas baseadas em seus tamanho e carga. As amostras fragmentadas do ADN são colocadas na câmara que contem o gel electrophoretic e dois eléctrodos.

Quando um campo elétrico é aplicado, os fragmentos migram para o eléctrodo positivo. Os fragmentos menores movem-se mais rapidamente através do gel que sae do maiores atrás e as amostras do ADN são separadas assim em faixas distintas no gel.

Visualização das faixas

O gel é tratado com as tinturas luminescentes a fim fazer as faixas do ADN visíveis.

Aplicações do RFLP

O RFLP foi usado para diversas aplicações genéticas da análise desde sua invenção.

Alguma destes fecha aplicações do RFLP está listada abaixo:

  • Para determinar o estado de doenças genéticas tais como a fibrose cística em um indivíduo.
  • Para determinar ou confirmar a fonte de uma amostra do ADN como em testes ou investigações penais de paternidade.
  • No traço genético para determinar as taxas de recombinação que mostram a distância genética entre os locus.
  • Para identificar um portador de uma mutação decausa em uma família.

Desvantagens do RFLP

Desde sua invenção, o RFLP foi técnicas amplamente utilizadas de uma análise do genoma empregadas na ciência forense, na medicina, e em estudos genéticos. Contudo, tornou-se quase obsoleto com o advento de ADN relativamente simples e menos caro que perfila tecnologias tais como a reacção em cadeia da polimerase (PCR).

O procedimento do RFLP exige etapas numerosas e toma semanas aos resultados do rendimento, quando as técnicas tais como o PCR puderem amplificar seqüências do ADN do alvo em um mero poucas horas.

Adicionalmente, o RFLP exige uma grande amostra do ADN, o isolamento de que pode ser um processo laborioso e demorado. Ao contrário, o PCR pode amplificar quantidades minúsculas de ADN em questão de horas.

Devido às razões numerosas tais como estes, a técnica do PCR substituiu pela maior parte o RFLP na maioria de aplicações que exigem o ADN que arranja em seqüência como o teste da paternidade ou a análise judicial da amostra.

Além disso, a identificação de polimorfismo do único-nucleotide no projecto de genoma humano substituiu quase a necessidade para o RFLP na análise do estado da doença.

Referências

Further Reading

Last Updated: Jun 26, 2019

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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    Cheriyedath, Susha. (2019, June 26). Técnica do polimorfismo de comprimento de fragmento (RFLP) de limitação. News-Medical. Retrieved on September 28, 2021 from https://www.news-medical.net/life-sciences/Restriction-Fragment-Length-Polymorphism-(RFLP)-Technique.aspx.

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Comments

  1. Rachael Bartram Rachael Bartram Australia says:

    when saying "For example, if there is a short sequence of GAGC that occurs repeatedly in a sample of DNA. The restriction endonuclease that recognizes the GAGC sequence cuts the DNA at every repetition of the GAGC pattern." what is GAGC?

  2. Satyajeet Khare Satyajeet Khare India says:

    I see a 1980 paper Botstein et al, AJMG which mentions RFLP.

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