Chromatographie à phase renversée

Par Jeyashree Sundaram, MBA

La chromatographie à phase renversée (RPC) est une technique de chromatographie liquide qui comporte la séparation des molécules sur la base des interactions hydrophobes entre les molécules de corps dissous dans la phase mobile et les ligands fixés à la phase stationnaire.

Concept d'à phase renversée

Dans les modèles classiques de chromatographie, la phase stationnaire est une phase polaire et la phase mobile est un solvant organique non polaire. Les constituants polaires dissous dans la phase mobile tendent à obtenir attirés à la phase stationnaire polaire, alors que les constituants non polaires tendent à obtenir élués avec le solvant.

Ceci forme la base pour la séparation. Ceci est connu en tant que chromatographie normale de phase. Un grand choix de propriétés biologiques s'échelonnant d'échange ionique à l'affinité biologique ont été employées pour la séparation des molécules.

Dans le RPC, des ligands alkyliques ou aromatiques sont en covalence liés à la phase stationnaire pour fournir une surface hydrophobe. La phase mobile réussissant au cours de la phase stationnaire hydrophobe est un solvant polaire contenant les corps dissous.

Dans ce scénario, les corps dissous hydrophobes dans la phase mobile tendent à devenir attachés à la phase stationnaire par l'intermédiaire des interactions hydrophobes et à former ainsi la base de la séparation. Car le principe ici est l'opposé de ce qui a été longtemps employé en chromatographie classique, ceci est connu en tant que chromatographie « à phase renversée ».

La modification en chromatographie à phase renversée

La composition chimique de la modification de base est importante dans le RPC car elle doit être chimiquement et structurellement niche. La silice et polystyrenesatisfy synthétiques ces conditions, et sont employés souvent en tant que matériaux de modification de RPC.

La dimension particulaire des talons est basée sur les besoins spécifiques de la séparation. Une plus grande taille de talon implique de plus grandes capacités et potentiellement peu de pressions. Les procédés préparatoires de grande puissance bénéficient à l'aide des talons d'un μm que 10 plus grand de diamètre ; les séparations préparatoires et analytiques à petite échelle, d'autre part, bénéficient avec des tailles de talons dans la gamme du μm 3-5.

Le choix du ligand est souvent régi par le principe qui plus le hydrophobicicity de la molécule pour être épuré est grand, moins est le besoin du ligand d'être hydrophobe. Ce principe a également mené à la règle qui a chimiquement synthétisé des peptides et des oligonucléotides mieux sont séparés avec les ligands C18 et qui la protéine et les peptides recombinés mieux sont séparé avec les ligands C8.

La densité des ligands immobilisés sur la surface des talons, la taille recouvrante de pore de chemistryand des talons sont d'autres facteurs à considérer pour une séparation à phase renversée couronnée de succès.

Phase mobile en chromatographie à phase renversée

Beaucoup de protocoles de RPC emploient l'ablend de l'eau et d'un solvant organique miscible (par exemple, acétonitrile ou méthylène) comme phase mobile. Le but du solvant organique est de mettre à jour la polarité bas à assez de niveau pour que le corps dissous dissolve dans la phase mobile mais assez le haut pour faciliter gripper de la molécule préférée avec la modification stationnaire.

Dans quelques scénarios, l'ion-appareillement des agents tels que l'acide trifluoroacetic peut également être ajouté. Une fois que la molécule d'intérêt est liée à la modification de fléau, elle est effectuée pour dissocier de elle en diminuant la polarité furtherby augmentant la concentration du solvant organique dans la phase mobile.

Ce procédé de varier la quantité de solvant organique dans la phase mobile pour séparer une molécule d'intérêt est élution de gradient appelée.

Chromatographie à phase renversée dans la pratique

La chromatographie liquide à phase renversée de haute performance (RP-HPLC) est devenue un puissant outil pour l'analyse des peptides et des protéines pour les raisons suivantes :

  • Stabilité vérifiée de la modification sous un grand choix de scénarios de phase mobile
  • Reproductibilité des séparations
  • Excellentes définitions réalisables pour des molécules d'intérêt (ou étroitement lié ou structurellement distinct)
  • Guérisons et débit appréciables
  • Facilité des séparations fournies par l'élution de gradient

Pour toutes ces raisons, RP-HPLC est devenu la méthode de choix pour la plupart des séparations basées sur CLHP. RP-HPLC a joué un rôle important dans la séparation des biomolécules (protéines, peptides, nucléotides) d'une grande variété de molécules synthétiques et biologiques, pour des applications analytiques et préparatoires.

À cause de la souplesse d'utilisation des sorbants à phase renversée au-dessus des sorbants de normal-phase, elles sont employées dans plus de 80% de séparations chromatographiques analytiques exécutées aujourd'hui. Des sorbants à phase renversée ont été avec succès employés dans les applications telles que la séparation analytique des médicaments, des métabolites, et des biomolécules ainsi qu'extraction actifs des contaminants dans les échantillons environnementaux.

La réussite des applications de RP-HPLC vues dans l'analyse et la purification des peptides, des petits polypeptides, et des médicaments pharmaceutiques n'a pas cependant été possible jusqu'au même degré avec des plus grands polypeptides (kDa >10) et les protéines globulaires, dues à la perte d'activité enzymatique et de puissances de pauvres à cause de la dénaturation de protéine pendant le procédé de séparation.

Last Updated: Feb 7, 2019

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