Cromatografia in controfase

Da Jeyashree Sundaram, MBA

La cromatografia in controfase (RPC) è una tecnica di cromatografia a fase mobile liquida che comprende la separazione di molecole in base alle interazioni idrofobe fra le molecole del soluto nella fase mobile ed i leganti fissati alla fase stazionaria.

Concetto di in controfase

Nei modelli classici della cromatografia, la fase stazionaria è una fase polare e la fase mobile è un solvente organico non polare. I componenti polari dissolti nella fase mobile tendono ad ottenere attirati verso la fase stazionaria polare, mentre i componenti non polari tendono ad ottenere eluiti con il solvente.

Ciò costituisce la base per la separazione. Ciò è conosciuta come cromatografia normale di fase. Vari beni biologici che variano da di scambio ionico all'affinità biologica sono stati usati per la separazione di molecole.

In RPC, i leganti alchilici o aromatici in covalenza sono limitati alla fase stazionaria per fornire una superficie idrofoba. La fase mobile che passa la fase stazionaria idrofoba è un solvente polare che contiene i soluti.

In questo scenario, i soluti idrofobi nella fase mobile tendono ad ottenere rilegati alla fase stazionaria via le interazioni idrofobe ed a costituire così la base della separazione. Poichè il principio qui è l'opposto di che cosa lungamente è stato utilizzato nella cromatografia classica, questo è conosciuto come cromatografia “in controfase„.

La matrice in cromatografia in controfase

La composizione chimica della matrice bassa è importante in RPC poichè deve essere sia chimicamente che strutturalmente stalla. La silice e polystyrenesatisfy sintetici questi requisiti e sono usati spesso come materiali di matrice del RPC.

La dimensione delle particelle delle perle è basata sui requisiti specifici della separazione. La più grande dimensione della perla implica le più grandi capacità e potenzialmente poche pressioni. I trattamenti preparatori su grande scala si avvantaggiano usando le perle di maggior μm di 10 del diametro; le separazioni preparatorie ed analitiche su scala ridotta, d'altra parte, si avvantaggiano con le dimensioni delle perle nell'intervallo del μm 3-5.

La scelta di legante è governata spesso dal principio che maggior il hydrophobicicity della molecola essere depurato, di meno è la necessità per il legante di essere idrofobo. Questo principio egualmente piombo alla norma che chimicamente ha sintetizzato i peptidi e gli oligonucleotidi sono separati il bene con i leganti C18 e che la proteina ed i peptidi recombinanti sono separati meglio con i leganti C8.

La densità dei leganti vincolati sulla superficie delle perle, la dimensione di coperchiamento del poro del chemistryand delle perle è ulteriori fattori da considerare per una riuscita separazione in controfase.

Fase mobile in cromatografia in controfase

Molti protocolli del RPC usano il ablend dell'acqua e di un solvente organico miscibile (per esempio, acetonitrile o metanolo) come la fase mobile. Lo scopo del solvente organico è di mantenere la polarità in basso ad un abbastanza livello affinchè il soluto si dissolva nella fase mobile ma abbastanza su per facilitare legare della molecola preferita con la matrice stazionaria.

In alcuni scenari, ione-accoppiare gli agenti quale acido trifluoroacetic può anche aggiungersi. Una volta che la molecola di interesse è limitata alla matrice di colonna, è fatta per dissociare da facendo diminuire la polarità furtherby aumentando la concentrazione del solvente organico nella fase mobile.

Questo trattamento di variazione della quantità di solvente organico nella fase mobile per separare una molecola di interesse è chiamato l'eluizione di gradiente.

Cromatografia in controfase in pratica

La cromatografia liquida a alta pressione in controfase (RP-HPLC) si è trasformata in in uno strumento potente per l'analisi dei peptidi e delle proteine per le seguenti ragioni:

  • Stabilità provata della matrice nell'ambito di vari scenari di fase mobile
  • Riproducibilità delle separazioni
  • Risoluzioni eccellenti realizzabili per le molecole di interesse (o strettamente connesso o strutturalmente distinto)
  • Ripristini e capacità di lavorazione apprezzabili
  • Facilità delle separazioni fornite da eluizione di gradiente

Per tutte queste ragioni, RP-HPLC si è trasformato nel metodo di scelta per la maggior parte delle separazioni HPLC basate. RP-HPLC ha svolto un ruolo principale nella separazione di biomolecole (proteine, peptidi, nucleotidi) da un'ampia varietà di molecole sintetiche e biologiche, per sia le applicazioni analitiche che preparatorie.

A causa della versatilità degli assorbenti in controfase sopra gli assorbenti di normale-fase, sono utilizzate più di 80% delle separazioni cromatografiche analitiche in realizzate in oggi. Gli assorbenti in controfase sono stati utilizzati con successo nelle applicazioni quale la separazione analitica di droghe, metaboliti e biomolecole attive come pure l'estrazione degli agenti inquinanti in campioni ambientali.

Il successo delle applicazioni di RP-HPLC vedute nell'analisi e nella depurazione dei peptidi, di piccoli polipeptidi e delle droghe farmaceutiche, tuttavia, non è stato possibile nella stessa misura con i più grandi polipeptidi (kDa >10) e le proteine globulari, dovuto perdita di rendimenti enzimatici del povero e di attività a causa di denaturazione della proteina durante il trattamento della separazione.

Sorgenti

 

Last Updated: Feb 7, 2019

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