cromatografia da Inverter-fase

Por Jeyashree Sundaram, MBA

a cromatografia da Inverter-fase (RPC) é uma técnica da cromatografia líquida que envolva a separação de moléculas com base em interacções hidrofóbicas entre as moléculas do solute na fase móvel e as ligantes anexadas à fase estacionária.

Conceito da inverter-fase

Em modelos clássicos da cromatografia, a fase estacionária é uma fase polar e a fase móvel é um solvente orgânico nonpolar. Os componentes polares dissolvidos na fase móvel tendem a obter atraídos à fase estacionária polar, quando os componentes nonpolar tenderem a obter eluted junto com o solvente.

Isto forma a base para a separação. Isto é sabido como a cromatografia normal da fase. Uma variedade de propriedades biológicas que variam da troca iónica à afinidade biológica foram usadas para a separação de moléculas.

No RPC, o alkyl ou as ligantes aromáticas são limitados covalently à fase estacionária para fornecer uma superfície hidrofóbica. A fase móvel que passa sobre a fase estacionária hidrofóbica é um solvente polar que contem os solutes.

Nesta encenação, os solutes hidrofóbicas na fase móvel tendem a obter encadernados à fase estacionária através das interacções hidrofóbicas e a formar assim a base da separação. Porque o princípio aqui é o oposto do que tem sido usado por muito tempo na cromatografia clássica, este é sabido como a cromatografia da “inverter-fase”.

A matriz na cromatografia da inverter-fase

A composição quimica da matriz baixa é importante no RPC porque tem que ser quimicamente e estrutural estábulo. O silicone e polystyrenesatisfy sintéticos estas exigências, e são usados frequentemente como materiais de matriz do RPC.

O tamanho de partícula dos grânulos é baseado nas exigências específicas da separação. O tamanho maior do grânulo implica capacidades maiores e potencial poucas pressões. Os processos preparatórios em grande escala beneficiam-se usando grânulos do maior μm de 10 do diâmetro; as separações preparatórios e analíticas em escala reduzida, por outro lado, beneficiam-se com tamanhos dos grânulos na escala do μm 3-5.

A escolha da ligante é governada frequentemente pelo princípio que maior o hydrophobicicity da molécula ser refinado, menos é a necessidade para que a ligante seja hidrofóbica. Este princípio igualmente conduziu à regra que sintetizaram quimicamente peptides e os oligonucleotides são separados melhor com ligantes C18 e que a proteína e os peptides de recombinação são separados melhor com ligantes C8.

A densidade das ligantes imobilizadas na superfície dos grânulos, o tamanho tampando do poro do chemistryand dos grânulos é uns factores mais adicionais a ser considerados para uma separação bem sucedida da inverter-fase.

Fase móvel na cromatografia da inverter-fase

Muitos protocolos do RPC usam o ablend da água e de um solvente orgânico miscible (por exemplo, acetonitrilo ou metanol) como a fase móvel. A finalidade do solvente orgânico é manter baixo a polaridade a bastante nível para que o solute dissolva-se na fase móvel no entanto altamente bastante facilite-se a ligação da molécula preferida com a matriz estacionária.

Em algumas encenações, íon-emparelhar agentes tais como o ácido trifluoroacetic pode igualmente ser adicionado. Uma vez que a molécula do interesse é limitada à matriz de coluna, está feita para separar-se dela diminuindo a polaridade furtherby aumentando a concentração do solvente orgânico na fase móvel.

Este processo de variar a quantidade de solvente orgânico na fase móvel para separar uma molécula do interesse é chamado eluição de inclinação.

cromatografia da Inverter-fase na prática

a cromatografia líquida do elevado desempenho da Inverter-fase (RP-HPLC) transformou-se uma ferramenta poderosa para a análise dos peptides e das proteínas para as seguintes razões:

  • Estabilidade testada da matriz sob uma variedade de encenações da fase móvel
  • Reprodutibilidade das separações
  • Definições excelentes realizáveis para moléculas do interesse (ou estreitamente relacionado ou estrutural distinto)
  • Recuperações e produção apreciáveis
  • Facilidade das separações fornecidas pela eluição de inclinação

Para todas estas razões, RP-HPLC transformou-se o método de escolha para a maioria de separações HPLC-baseadas. RP-HPLC jogou um maior protagonismo na separação de biomoléculas (proteínas, peptides, nucleotides) de uma grande variedade de moléculas sintéticas e biológicas, para aplicações analíticas e preparatórios.

Devido à versatilidade de sorbents da inverter-fase sobre sorbents da normal-fase, são usados mais de 80% das separações cromatográficas analíticas no executadas hoje. os sorbents da Inverter-fase foram usados com sucesso nas aplicações tais como a separação analítica de drogas, metabolitos, e biomoléculas assim como extracção activas dos contaminadores em amostras ambientais.

O sucesso das aplicações de RP-HPLC consideradas na análise e na purificação dos peptides, de polipeptídeos pequenos, e de drogas farmacêuticas, contudo, não foi possível à mesma extensão com polipeptídeos maiores (kDa >10) e as proteínas globulares, devido à perda de rendimentos enzimáticos da actividade e dos pobres devido à desnaturação da proteína durante o processo da separação.

Fontes

 

Last Updated: Feb 7, 2019

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