Cromatografía inversa

Por Jeyashree Sundaram, MBA

La cromatografía inversa (RPC) es una técnica de la cromatografía líquida que implica la separación de moléculas en base de acciones recíprocas hidrofóbicas entre las moléculas del soluto en la fase movible y los ligands sujetados a la fase estacionaria.

Concepto de inverso

En modelos clásicos de la cromatografía, la fase estacionaria es una fase polar y la fase movible es un disolvente orgánico no polar. Los componentes polares disueltos en la fase movible tienden a conseguir atraídos a la fase estacionaria polar, mientras que los componentes no polares tienden a conseguir enjuagados junto con el disolvente.

Esto forma la base para la separación. Esto se conoce como cromatografía normal de la fase. Una variedad de propiedades biológicas que colocaban de intercambio iónico a la afinidad biológica se han utilizado para la separación de moléculas.

En el RPC, los ligands alkílicos o aromáticos covalente están limitados a la fase estacionaria para ofrecer una superficie hidrofóbica. La fase movible que pasa durante la fase estacionaria hidrofóbica es un disolvente polar que contiene los solutos.

En este decorado, los solutos hidrofóbicos en la fase movible tienden a conseguir encuadernados a la fase estacionaria vía acciones recíprocas hidrofóbicas y a formar así la base de la separación. Pues el principio aquí es el contrario de qué se ha utilizado de largo en cromatografía clásica, esto se conoce como cromatografía “inversa”.

La matriz en la cromatografía inversa

La composición química de la matriz baja es importante en el RPC pues tiene que estar químicamente y estructural establo. El sílice y polystyrenesatisfy sintetizados estos requisitos, y son de uso frecuente como materiales de matriz del RPC.

La talla de partícula de las molduras se basa en los requisitos específicos de la separación. Una talla más grande de la moldura implica capacidades más grandes y potencialmente pocas presiones. Los procesos preparatorios en grande se benefician usando molduras del mayor μm de 10 del diámetro; las separaciones preparatorias y analíticas a escala reducida, por otra parte, se benefician con tallas de las molduras en el alcance del μm 3-5.

La opción del ligand es regulada a menudo por el principio que cuanto mayor es el hydrophobicicity de la molécula ser purificado, menos es la necesidad del ligand de ser hidrofóbico. Este principio también ha llevado a la regla que químicamente sintetizaron los péptidos y los oligonucleótidos se separan mejor con los ligands C18 y que se separan la proteína y los péptidos recombinantes mejor con los ligands C8.

La densidad de los ligands inmovilizados en la superficie de las molduras, la talla del poro del chemistryand que capsula de las molduras es otros factores que se considerarán para una separación inversa acertada.

Fase movible en la cromatografía inversa

Muchos protocolos del RPC utilizan el ablend del agua y de un disolvente orgánico miscible (e.g., acetonitrilo o metanol) como la fase movible. El propósito del disolvente orgánico es mantener la polaridad en bajo un suficiente nivel para que el soluto disuelva en la fase movible pero arriba bastante facilite atar de la molécula preferida con la matriz estacionaria.

En algunos decorados, ión-emparejar agentes tales como ácido trifluoracético puede también ser agregada. Una vez que la molécula del interés está limitada a la matriz de olumna, es hecha para disociar de ella disminuyendo la polaridad furtherby aumentando la concentración del disolvente orgánico en la fase movible.

Este proceso de variar la cantidad de disolvente orgánico en la fase movible para separar una molécula del interés se llama elución de gradiente.

Cromatografía inversa en la práctica

La cromatografía líquida inversa del alto rendimiento (RP-HPLC) se ha convertido en una herramienta potente para el análisis de péptidos y de proteínas por las razones siguientes:

  • Estabilidad probada de la matriz bajo una variedad de decorados de la fase movible
  • Reproductibilidad de separaciones
  • Resoluciones excelentes realizables para las moléculas del interés (o estrechamente vinculado o estructural distinto)
  • Recuperaciones y producción apreciables
  • Facilidad de las separaciones ofrecidas por la elución de gradiente

Por todas estas razones, RP-HPLC se ha convertido en el método de opción para la mayoría de las separaciones CLAR-basadas. RP-HPLC ha desempeñado un papel principal en la separación de biomoléculas (proteínas, péptidos, nucleótidos) de una amplia variedad de moléculas sintetizadas y biológicas, para los usos analíticos y preparatorios.

Debido a la flexibilidad de los absorbentes inversos sobre los absorbentes de la normal-fase, se utilizan en más el de 80% de separaciones cromatográficas analíticas realizadas hoy. Los absorbentes inversos se han utilizado con éxito en usos tales como separación analítica de drogas, los metabilitos, y las biomoléculas así como extracción activas de contaminantes en muestras ambientales.

El éxito de los usos de RP-HPLC considerados en el análisis y la purificación de péptidos, de pequeños polipéptidos, y de drogas farmacéuticas, sin embargo, no ha sido posible al mismo fragmento con polipéptidos más grandes (kDa >10) y proteínas globulares, debido a la baja de los rendimientos enzimáticos de la actividad y de los pobres debido a la desnaturalización de la proteína durante el proceso de la separación.

Fuentes

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Last Updated: Jun 26, 2019

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