Ordonnancement de Sanger

Le premier ADN ordonnançant la méthode a été développé par Frederick Sanger en 1977. La technique a été basée sur la constitution des dideoxynucleotides réseau-mettants fin par l'ADN polymérase tout en reproduisant l'ADN. Ainsi au lieu de beaucoup de copies du plein réseau d'ADN, il y aurait des copies de toutes les différentes longueurs du réseau, finissant à chaque tige, pour chaque tige du réseau. Ces séquences peuvent alors être séparées utilisant l'électrophorèse en gel de polyacrylamide.

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illustration 3D d'une méthode d'ordonnancement d'ADN. Crédit d'image : ktsdesign/Shutterstock

Les ingrédients pour l'ordonnancement de Sanger sont :

  • une matrice monocatenaire d'ADN
  • amorces pour commencer le réseau neuf d'ADN
  • ADN polymérase
  • deoxynucleosidetriphosphates normaux (dNTPs)
  • réseau-mettant fin à des Di-deoxynucleosidetriphosphates (ddNTPs)

Les ddNTPs ont une marque fluorescente ou radioactive fixée pour le dépistage. Réseau-mettant fin les ddNTPs manquent d'un groupe de l'OH à l'extrémité 3 principale (3' - l'OH) de la molécule. C'est où le prochain nucléotide serait fixé par une obligation de phosphodiester si la séquence prolongée.

Le protocole

Quatre réactions de ordonnancement sont produites pour chacun des nucléotides actuels dans l'ADN : adénosine, guanine, cytosine, et thymines. Un des quatre deoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP, ou dTTP) est ajouté à chaque récipient de réaction.

La synthèse d'ADN commence d'une amorce liée à la boucle de matrice. Une deuxième boucle est assemblée sur la matrice, produisant un ADN bicaténaire.  À la fin de l'opération, dans chaque récipient de réaction, le réseau met fin à chaque fois qu'un ddNTP est fait au hasard comporté, ayant pour résultat les réseaux dont la longueur correspond à tout l'emplacement de ce nucléotide spécifique.

Dans le récipient avec le dATP, par exemple, il y aurait des réseaux mettant fin à chaque position d'A, et ainsi de suite. Le récipient de réaction est passionné, séparant les réseaux, et alors refroidi de nouveau de sorte que la réaction relance avec les amorces fraîches. La réaction en général est thermiquement faite un cycle environ trente-cinq fois. Traditionnellement les réactions sont séparées côte à côte sur un gel, et le résultat peut « être affiché de gauche à droite », de haut en bas.

Vu la taille et la complexité du génome, cette méthode en peuvent être laborieuses pour effectuer à la main pour mais le plus court des séquences. L'ordonnancement de Sanger habituellement est maintenant automatisé, ainsi des douzaines de ordonnancement de passages de machine de lots d'ADN par jour et sépare les réseaux par électrophorèse capillaire. Une autre opération en automatisant et en simplifiant le procédé est d'exécuter la réaction entière sur une frite microfluidic.

Méthode de terminateur de teinture

Une avance sur l'ordonnancement de Sanger est la méthode de teinture-terminateur. Au lieu d'effectuer quatre réactions dans des quatre récipients différents utilisant les amorces marquées, les différents ddNTPs sont marqués avec les teintures fluorescentes, chacune qui émet à une longueur d'onde différente, ainsi les quatre bases apparaîtront en tant que différentes couleurs quand passage simultanément sur un gel. l'ordonnancement de Sanger de Teinture-terminateur est maintenant la méthode de choix pour l'ordonnancement robotisé dû à sa simplicité relative.

L'ordonnancement de Sanger peut afficher des réseaux jusqu'à environ 800 paires de bases. C'est une méthode génomique fondamentale et est toujours employé pour beaucoup d'applications exigeant des longueurs sous peu relevées. Cependant, pendant les années 80 et les années 90, les biologistes moléculaires ont commencé à travailler vers ordonnancer le génome humain entier, qui contient environ trois milliards de paires de bases.

Les chercheurs ont également voulu effectuer le séquençage du génome entier sur l'autre substance. Des méthodes par conséquent plus neuves comprenant l'ordonnancement de fusil de chasse, Illumina ordonnançant, et l'ordonnancement de la deuxième génération ont été développés pour relever le défi d'ordonnancer les gènes et les génomes entiers.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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