Ordinamento di Sanger

Il primo DNA che ordina il metodo è stato sviluppato da Frederick Sanger nel 1977. La tecnica è stata basata sull'incorporazione dei dideoxynucleotides diterminazione dalla DNA polimerasi mentre ripiegava il DNA. Così invece di molte copie della catena piena del DNA, ci sarebbero copie di tutte le lunghezze differenti della catena, cessanti ad ogni collegamento, per ogni collegamento della catena. Queste sequenze possono poi essere separate facendo uso dell'elettroforesi del gel di poliacrilammide.

illustrazione 3D di un metodo di ordinamento del DNA. credito di immagine: ktsdesign/Shutterstock
illustrazione 3D di un metodo di ordinamento del DNA. Credito di immagine: ktsdesign/Shutterstock

Gli ingredienti per l'ordinamento di Sanger sono:

  • un modello unico incagliato del DNA
  • mani di fondo per cominciare la nuova catena del DNA
  • DNA polimerasi
  • deoxynucleosidetriphosphates normali (dNTPs)
  • catena-terminando i Di-deoxynucleosidetriphosphates (ddNTPs)

I ddNTPs hanno un contrassegno fluorescente o radioattivo fissato per rilevazione. Catena-terminando i ddNTPs mancano di un gruppo dell'OH 3 all'estremità principale (3' - l'OH) della molecola. Ciò è dove il nucleotide seguente sarebbe fissato da un'obbligazione di phosphodiester se la sequenza continuasse.

Il protocollo

Le quattro reazioni d'ordinamento sono create per ciascuno dei nucleotidi presenti in DNA: adenosina, guanina, citosina e timine. Uno dei quattro deoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP, o dTTP) si aggiunge ad ogni imbarcazione della reazione.

La sintesi del DNA comincia da una mano di fondo limitata al filo del modello. Un secondo filo è montato sopra il modello, creante un DNA a doppia elica.  Alla conclusione del trattamento, in ogni imbarcazione della reazione, la catena termina ogni volta che un ddNTP è compreso a caso, con conseguente catene di cui la lunghezza corrisponde a tutte le posizioni di quel nucleotide specifico.

Nell'imbarcazione con dATP, per esempio, ci sarebbero catene che terminano ad ogni posizione di A, e così via. L'imbarcazione della reazione è heated, separando le catene ed allora raffreddato ancora in modo che la reazione ricominci con le mani di fondo fresche. La reazione è ciclata in genere termicamente circa trentacinque volte. Le reazioni sono separate tradizionalmente parallelamente su un gel ed il risultato può “essere letto„ da sinistra a destra, longitudinale.

Dato la dimensione e la complessità del genoma, questo metodo può essere laborioso effettuare a mano per c'è ne ma il più breve delle sequenze. L'ordinamento di Sanger ora è automatizzato solitamente, così un sequenziatore esegue dozzine di batch del DNA al giorno e separa le catene tramite l'elettroforesi capillare. Un punto ulteriore nell'automatizzare e nella facilitazione del trattamento è di eseguire l'intera reazione su un chip microfluidic.

Metodo del terminatore della tintura

Un avanzamento sull'ordinamento di Sanger è il metodo del tintura-terminatore. Invece di avanzamento delle quattro reazioni in quattro imbarcazioni differenti facendo uso delle mani di fondo contrassegnate, i ddNTPs differenti sono contrassegnati con le tinture fluorescenti, ciascuna che emette ad una lunghezza d'onda differente, in modo dalle quattro basi riveleranno come colori differenti quando esecuzione simultaneamente su un gel. l'ordinamento di Sanger del Tintura-terminatore ora è il metodo di scelta per l'ordinamento automatizzato dovuto la sua semplicità relativa.

L'ordinamento di Sanger può leggere le catene fino a circa 800 coppie di basi. È un metodo fondamentale di genomica ed ancora è usato per molte applicazioni che richiedono le lunghezze bruscamente colte. Tuttavia, durante gli anni 80 e gli anni 90, i biologi molecolari hanno cominciato a lavorare verso l'ordinamento del genoma umano intero, che contiene circa tre miliardo coppie di basi.

I ricercatori egualmente hanno voluto effettuare l'intero sequenziamento del genoma su altre specie. I metodi di conseguenza più nuovi compreso l'ordinamento del fucile da caccia, Illumina che ordinano e l'ordinamento di prossima generazione sono stati messi a punto per incontrare la sfida di ordinamento i geni e dei genoma interi.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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