Arranjar em seqüência de Sanger

O primeiro ADN que arranja em seqüência o método foi desenvolvido por Frederick Sanger em 1977. A técnica foi baseada na incorporação de dideoxynucleotides determinação pela polimerase de ADN ao replicating o ADN. Assim em vez de muitas cópias da corrente completa do ADN, haveria umas cópias de todos os comprimentos diferentes da corrente, terminando em cada relação, para cada relação da corrente. Estas seqüências podem então ser separadas usando a electroforese do gel de polyacrylamide.

ilustração 3D de um método de arranjar em seqüência do ADN. crédito de imagem: ktsdesign/Shutterstock
ilustração 3D de um método de arranjar em seqüência do ADN. Crédito de imagem: ktsdesign/Shutterstock

Os ingredientes para arranjar em seqüência de Sanger são:

  • um molde único-encalhado do ADN
  • primeiras demão para começar a corrente nova do ADN
  • Polimerase de ADN
  • deoxynucleosidetriphosphates normais (dNTPs)
  • corrente-terminando di-deoxynucleosidetriphosphates (ddNTPs)

Os ddNTPs têm uma etiqueta fluorescente ou radioactiva anexada para a detecção. Corrente-terminando os ddNTPs faltam um grupo do OH na extremidade 3 principal (3' - OH) da molécula. Isto é o lugar onde o nucleotide seguinte seria anexado por uma ligação de phosphodiester se a seqüência continuou.

O protocolo

Quatro reacções arranjando em seqüência são criadas para cada um dos nucleotides actuais no ADN: adenosina, guanina, cytosine, e thymine. Um dos quatro deoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP, ou dTTP) é adicionado a cada embarcação da reacção.

A síntese do ADN começa de uma primeira demão limitada à costa do molde. Uma segunda costa é montada sobre o molde, criando um ADN encalhado dobro.  No fim do processo, em cada embarcação da reacção, a corrente termina sempre que um ddNTP é incorporado aleatòria, tendo por resultado as correntes cujo o comprimento corresponde a todos os lugar desse nucleotide específico.

Na embarcação com dATP, por exemplo, haveria correntes que terminam em cada posição de A, e assim por diante. A embarcação da reacção é caloroso, separando as correntes, e de refrigeração então outra vez de modo que a reacção reinicie com primeiras demão frescas. A reacção é dada um ciclo tipicamente tèrmica aproximadamente trinta e cinco vezes. As reacções são separadas tradicional de lado a lado em um gel, e o resultado pode “ser lido” da esquerda para a direita, de cima para baixo.

Dado o tamanho e a complexidade do genoma, este método pode ser laborioso realizar-se à mão para alguns mas o mais curto das seqüências. Arranjar em seqüência de Sanger geralmente é automatizado agora, assim dúzias arranjando em seqüência das corridas de máquina de grupos do ADN pelo dia e separa as correntes pela electroforese capilar. Uma etapa mais adicional em automatizar e em simplificar o processo é executar a reacção inteira em uma microplaqueta microfluidic.

Método do terminal da tintura

Um avanço em arranjar em seqüência de Sanger é o método do tintura-terminal. Em vez de realizar quatro reacções em quatro embarcações diferentes usando primeiras demão etiquetadas, os ddNTPs diferentes são etiquetados com tinturas fluorescentes, cada um que emite-se em um comprimento de onda diferente, assim que as quatro bases aparecerão como cores diferentes quando corrida simultaneamente em um gel. arranjar em seqüência de Sanger do Tintura-terminal é agora o método de escolha para arranjar em seqüência automatizado devido a sua simplicidade relativa.

Arranjar em seqüência de Sanger pode ler correntes até aproximadamente 800 pares baixos. É um método fundacional da genómica e é usado ainda para muitas aplicações que exigem comprimentos lidos curtos. Contudo, durante os anos 80 e os anos 90, os biólogos moleculars começaram a trabalhar para arranjar em seqüência o genoma humano inteiro, que contem aproximadamente três bilhão pares baixos.

Os pesquisadores igualmente quiseram realizar o genoma inteiro que arranja em seqüência na outra espécie. Uns métodos conseqüentemente mais novos que incluem arranjar em seqüência da espingarda, Illumina que arranja em seqüência, e arranjar em seqüência da próxima geração foram desenvolvidos para encontrar o desafio de arranjar em seqüência genes e genomas inteiros.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

Written by

Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

Citations

Please use one of the following formats to cite this article in your essay, paper or report:

  • APA

    Shaffer, Catherine. (2019, February 26). Arranjar em seqüência de Sanger. News-Medical. Retrieved on December 11, 2019 from https://www.news-medical.net/life-sciences/Sanger-Sequencing.aspx.

  • MLA

    Shaffer, Catherine. "Arranjar em seqüência de Sanger". News-Medical. 11 December 2019. <https://www.news-medical.net/life-sciences/Sanger-Sequencing.aspx>.

  • Chicago

    Shaffer, Catherine. "Arranjar em seqüência de Sanger". News-Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/Sanger-Sequencing.aspx. (accessed December 11, 2019).

  • Harvard

    Shaffer, Catherine. 2019. Arranjar em seqüência de Sanger. News-Medical, viewed 11 December 2019, https://www.news-medical.net/life-sciences/Sanger-Sequencing.aspx.

Comments

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News-Medical.Net.
Post a new comment
Post