Secuencia de Sanger

La primera DNA que ordenaba método fue desarrollada por Frederick Sanger en 1977. La técnica fue basada en la incorporación de dideoxynucleotides cadena-terminales por la polimerasa de DNA mientras que replegaba la DNA. Tan en vez de muchas copias de la cadena completa de la DNA, habría copias de todos los diversos largos de la cadena, terminando en cada eslabón, para cada eslabón de la cadena. Estas series se pueden entonces separar usando electroforesis del gel de poliacrilamida.

ejemplo 3D de un método de secuencia de la DNA. haber de imagen: ktsdesign/Shutterstock
ejemplo 3D de un método de secuencia de la DNA. Haber de imagen: ktsdesign/Shutterstock

Los ingredientes para la secuencia de Sanger son:

  • un patrón de una sola fila de la DNA
  • pinturas de fondo para comenzar la nueva cadena de la DNA
  • Polimerasa de DNA
  • deoxynucleosidetriphosphates normales (dNTPs)
  • cadena-terminando los di-deoxynucleosidetriphosphates (ddNTPs)

Los ddNTPs tienen una escritura de la etiqueta fluorescente o radioactiva sujetada para la detección. Cadena-terminando los ddNTPs faltan a un grupo del OH en el extremo primero 3 (3' - OH) de la molécula. Aquí es donde el nucleótido siguiente sería sujetado por una ligazón de phosphodiester si la serie continuó.

El protocolo

Cuatro reacciones de secuencia se crean para cada uno de los nucleótidos presentes en la DNA: adenosina, guanina, citosina, y thymine. Uno de los cuatro deoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP, o dTTP) se agrega a cada buque de la reacción.

La síntesis de la DNA comienza de una pintura de fondo limitada al cabo del patrón. Un segundo cabo se monta encima del patrón, creando una DNA trenzada doble.  En el final del proceso, en cada buque de la reacción, la cadena termina siempre que un ddNTP se incorpore aleatoriamente, dando por resultado las cadenas cuyo largo corresponde a todas las situaciones de ese nucleótido específico.

En el buque con el dATP, por ejemplo, habría cadenas que terminan en cada posición de A, y así sucesivamente. El buque de la reacción es heated, separando las cadenas, y entonces enfriado otra vez de modo que la reacción recomience con las pinturas de fondo frescas. La reacción se completa un ciclo típicamente térmicamente cerca de treinta y cinco veces. Las reacciones se separan tradicionalmente de lado a lado en un gel, y el resultado se puede “leer” de izquierda a derecha, de arriba a abajo.

Dado la talla y la complejidad del genoma, este método puede ser laborioso realizar a mano para ningunos pero el más corto de series. La secuencia de Sanger ahora se automatiza, así las docenas de secuencia de las corridas de una máquina de mezclas de la DNA por día y separa generalmente las cadenas por la electroforesis capilar. Otro paso en la automatización y la simplificaión del proceso es realizar la reacción entera en una viruta microfluidic.

Método del adaptador del tinte

Un avance en la secuencia de Sanger es el método del tinte-adaptador. En vez de realizar cuatro reacciones en cuatro diversos buques usando las pinturas de fondo etiqueta, los diversos ddNTPs etiqueta con los tintes fluorescentes, cada uno que emite en una diversa longitud de onda, así que las cuatro bases aparecerán como diversos colores cuando corrida simultáneamente en un gel. la secuencia de Sanger del Tinte-adaptador ahora es el método de opción para la secuencia automatizada debido a su simplicidad relativa.

La secuencia de Sanger puede leer cadenas hasta cerca de 800 pares bajos. Es un método fundacional de la genómica y todavía se utiliza para muchos usos que requieren largos brevemente leídos. Sin embargo, durante los años 80 y los años 90, los biólogos moleculares comenzaron a trabajar hacia la secuencia del genoma humano entero, que contiene cerca de tres mil millones pares bajos.

Los investigadores también quisieron realizar el genoma entero que ordenaba en la otra especie. Por lo tanto más nuevos métodos incluyendo la secuencia de la escopeta, Illumina que ordenaba, y secuencia de la siguiente-generación se han desarrollado para hacer frente al reto de ordenar genes y los genomas enteros.

Fuentes

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

Written by

Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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