Actuel, les deux méthodes les plus populaires d'ordonnancement d'ADN sont Sanger ordonnançant et ordonnancement de prochain rétablissement (NGS). Tandis que NGS a en grande partie rattrapé Sanger ordonnançant, il est encore employé par des chercheurs aujourd'hui dus à sa simplicité et simplicité d'utilisation.
Crédit : ktsdesign/Shutterstock
L'ordonnancement de Sanger a été développé pendant les années 1970 par Frederick Sanger et était l'ADN originel ordonnançant la méthode.
Dans l'ordonnancement de Sanger, réseau-mettant fin au nucléoside des bases sont comportées à la réaction de réplication de l'ADN. Ceci donne droit dans une série de réseaux d'ADN tronqués à chaque paire de bases dans la séquence. La séquence est alors affichée en séparant ces réseaux sur un gel de polyacrylamide.
Le prochain rétablissement est une méthode plus neuve qui peut être employée pour séquencer des pièces d'ADN beaucoup plus grandes, ou même les génomes entiers. Il est basé sur ordonnancer pendant la réaction de synthèse d'ADN. La réaction est effectuée sur une surface fixe. Chaque fois que une base est ajoutée, l'information neuve de séquence est affichée. Des milliers de réactions peuvent être ordonnancés simultanément.
Illumina
La plate-forme de ordonnancement de la deuxième génération dominante est Illumina. Elle a été initialement développée par la compagnie Solexa basé sur une technologie de choix, amplification de passerelle, de Pascal Meyer et d'autres, avant d'être améliorée au moment par des scientifiques de Solexa. Cette technologie a été acquise par Illumina en 2007.
La méthode d'Illumina a un concept assimilé à l'ordonnancement de Sanger. Dans l'ordonnancement de Sanger, réseau-mettant fin des Di-deoxynucleosidetriphosphates (ddNTPs) sont comportés aux réseaux d'ADN pendant la réplication de l'ADN utilisant la matrice ADN et une amorce pour commencer la réaction.
Dans Illumina ordonnançant, des terminateurs réversibles sont fixés aux deoxynucleosidetriphosphates réguliers (dNTPs). Le terminateur bloque la prolonge du réseau d'ADN.
Cependant, les terminateurs sont réversibles, ainsi après lecture, le terminateur est retiré et une autre base est ajoutée au réseau. Le cycle est alors répété pour la pleine longueur relevée de l'éclat.
Dépistage
Dans Sanger ordonnançant, les réseaux mis fin sont séparés sur un gel de polyacrylamide. Les amorces (dNTPs) sont marquées avec un isotope radioactif, ou, généralement, une marque fluorescente. La séquence est alors donnée lecture d'un seul trait. Avec le dépistage de fluorescence, quatre couleurs fluorescentes différentes sont employées pour discerner les différentes bases.
Pour Illumina ordonnançant, le dépistage est effectué utilisant une marque fluorescente a collé le dNTP. Une teinture fluorescente unique est employée pour toutes les bases, et chaque dNTP est ajouté séparé pour les discerner les uns des autres.
Puissance de séquence d'ADN
La différence pratique primaire entre Sanger ordonnançant et ordonnancement de prochain rétablissement est la puissance de caractéristiques de séquence.
La machine de ordonnancement d'Illumina peut produire jusqu'à 20 bases méga (Mb) par heure avec une longueur indiquée de 100 bases à partir des deux extrémités de la matrice. L'ordonnancement de Sanger de gel de brame produit 0,0672 Mb/hr avec une longueur relevée du point d'ébullition 700.
Coût
Le coût relatif d'ordonnancement de Sanger est plus élevé que NGS. L'ordonnancement de Sanger est estimé à environ $500 selon 1000 bases, comparées moins de $0,50 selon 1000 bases pour NGS, selon une étude 2011.
Quand employer l'ordonnancement de Sanger
Le prochain rétablissement ordonnançant la technologie est maintenant préféré pour certaines fonctions. Ceux comprennent :
- ordonnançant plus de 100 gènes simultanément
- expansion du nombre d'objectifs pour trouver des variantes nouvelles
- échantillons avec des quantités inférieures d'entrée de produit de départ
- génomes microbiens pour l'agent pathogène subtyping dans des situations critiques de manifestation
L'ordonnancement de Sanger est toujours un bon choix quand :
- ordonnancement des gènes uniques
- L'ordonnancement de l'amplicon vise jusqu'à 100 paires de bases
- ordonnancement de 96 échantillons ou de moins
- recensement des microbes
- analyser des éclats
- analyser des séquences répétées en tandem courtes (STRs)
Further Reading