Sanger che ordina e che ordina di prossima generazione confrontato

Corrente, i due metodi più popolari di ordinamento del DNA sono Sanger che ordina ed ordinamento della generazione seguente (NGS). Mentre NGS in gran parte ha sorpassato Sanger che ordina, ancora è usato oggi dai ricercatori dovuto la sue semplicità e facilità d'uso.

Credito: ktsdesign/Shutterstock

L'ordinamento di Sanger è stato sviluppato negli anni 70 da Frederick Sanger ed era il DNA originale che ordina il metodo.

Nell'ordinamento di Sanger, catena-terminante il nucleoside le basi sono comprese nella reazione del replicazione del dna. Ciò risulta in una serie delle catene del DNA tronche ad ogni coppia di basi nella sequenza. La sequenza poi è letta separando queste catene su un gel di poliacrilammide.

La generazione seguente è un più nuovo metodo che può essere usato per ordinare i pezzi di DNA molto più grandi, o persino interi genoma. È basata sull'ordinamento durante la reazione della sintesi del DNA. La reazione è effettuata su una superficie fissa. Ogni volta una base si aggiunge, le nuove informazioni di sequenza sono lette. Migliaia di reazioni possono essere ordinate simultaneamente.

Illumina

La piattaforma d'ordinamento di prossima generazione dominante è Illumina. Originalmente è stata sviluppata dalla società Solexa basato su una tecnologia di schiera, amplificazione del ponte, da Pascal Meyer ed altri, prima del miglioramento su dagli scienziati di Solexa. Questa tecnologia si è acquistata da Illumina nel 2007.

Il metodo di Illumina ha un simile concetto all'ordinamento di Sanger. Nell'ordinamento di Sanger, catena-terminante i Di-deoxynucleosidetriphosphates (ddNTPs) sono incorporati nelle catene del DNA durante il replicazione del dna facendo uso del DNA del modello e di una mano di fondo per cominciare la reazione.

In Illumina che ordina, i terminatori reversibili sono fissati ai deoxynucleosidetriphosphates regolari (dNTPs). Il terminatore blocca l'estensione della catena del DNA.

Tuttavia, i terminatori sono reversibili, in modo da dopo la lettura, il terminatore è eliminato e un'altra base si aggiunge alla catena. Il ciclo poi è ripetuto per la lunghezza colta completa del frammento.

Rilevazione

In Sanger che ordina, le catene terminate sono separate su un gel di poliacrilammide. Le mani di fondo (dNTPs) sono contrassegnate con un isotopo radioattivo, o, più comunemente, un contrassegno fluorescente. La sequenza poi è letta tutto d'un tratto fuori. Con rilevazione della fluorescenza, quattro colori fluorescenti differenti sono usati per distinguere le basi differenti.

Per Illumina che ordina, la rilevazione è effettuata facendo uso di un contrassegno fluorescente ha saldato il dNTP. Una singola tintura fluorescente è usata per tutte le basi ed ogni dNTP si aggiunge esclusivamente per distinguerli l'uno dall'altro.

Rendimento di sequenza del DNA

La differenza pratica primaria fra Sanger che ordina ed ordinamento della generazione seguente è il rendimento dei dati di sequenza.

Il sequenziatore di Illumina può produrre fino a 20 basi mega (Mb) all'ora con una lunghezza indicata di 100 basi da entrambe le estremità del modello. L'ordinamento di Sanger del gel della bramma produce 0,0672 Mb/hr con una lunghezza colta di 700 B.P.

Costo

Il costo relativo di ordinamento di Sanger è superiore a NGS. L'ordinamento di Sanger è stimato a circa $500 per 1000 basi, confrontate a meno di $0,50 per 1000 basi per NGS, secondo uno studio 2011.

Quando usare ordinamento di Sanger

La generazione seguente che ordina la tecnologia ora è preferita per determinati processi. Quelli includono:

  • ordinando più di 100 geni simultaneamente
  • ampliamento del numero degli obiettivi per trovare le varianti novelle
  • campioni con gli importi bassi dell'input di prodotto base
  • genoma microbici per l'agente patogeno che subtyping nelle situazioni critiche di scoppio

L'ordinamento di Sanger è ancora una buona scelta quando:

  • ordinamento dei geni singoli
  • L'ordinamento del amplicon mira a fino a 100 coppie di basi
  • ordinamento 96 campioni o del di meno
  • identificazione dei microbi
  • analizzare i frammenti
  • analizzare le brevi ripetizioni in tandem (STRs)

Sorgenti

Further Reading

Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

Written by

Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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Comments

  1. Nick McCooke Nick McCooke United Kingdom says:

    You are incorrect in saying that ‘Illumina NGS’ was developed by David Klenerman at the University of Cambridge. The technology was developed by the company Solexa based on the initial ideas of David Klenerman and Shankar Balasubramanian and others. David and Shankar were founding scientists of Solexa. However the technology actually developed at U. Cambridge, Single Molecule Arrays, did not work and did not find its way into the commercial platform. Instead an array technology, bridge amplification, developed by Pascal Meyer and others in Geneva, with no connection to Cambridge University, and acquired by Solexa, was used in the commercial platform. The sequencing chemistry was invented and developed by Solexa, by Solexa scientists, and not at the University of Cambridge. Implying otherwise is a disservice to the Solexa team.
    Nick McCooke
    Former CEO, Solexa

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