Actualmente, os dois métodos os mais populares de arranjar em seqüência do ADN são Sanger que arranja em seqüência e arranjar em seqüência da próxima geração (NGS). Enquanto NGS alcançou pela maior parte Sanger que arranja em seqüência, está usado ainda pelos pesquisadores hoje devido a suas simplicidade e acessibilidade.
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Arranjar em seqüência de Sanger foi desenvolvido nos anos 70 por Frederick Sanger e era o ADN original que arranja em seqüência o método.
Em arranjar em seqüência de Sanger, corrente-terminando o nucleoside as bases são incorporadas na reacção da réplica do ADN. Isto conduz a uma série de correntes do ADN truncadas em cada par baixo na seqüência. A seqüência é lida então separando estas correntes em um gel de polyacrylamide.
A próxima geração é um método mais novo que possa ser usado para arranjar em seqüência partes muito maiores de ADN, ou mesmo genomas inteiros. É baseada em arranjar em seqüência durante a reacção da síntese do ADN. A reacção é realizada em uma superfície fixa. Cada vez que uma base é adicionada, a informação nova da seqüência está lida. Os milhares de reacções podem ser arranjados em seqüência simultaneamente.
Illumina
A próxima geração dominante que arranja em seqüência a plataforma é Illumina. Foi desenvolvida originalmente pela empresa Solexa baseado em uma tecnologia da disposição, amplificação da ponte, de Pascal Meyer e outro, antes de ser melhorado por cientistas de Solexa. Esta tecnologia foi adquirida por Illumina em 2007.
O método de Illumina tem um conceito similar a arranjar em seqüência de Sanger. Em arranjar em seqüência de Sanger, corrente-terminando os di-deoxynucleosidetriphosphates (ddNTPs) são incorporados em correntes do ADN durante a réplica do ADN usando o ADN do molde e uma primeira demão para começar a reacção.
Em Illumina que arranja em seqüência, os terminais reversíveis são anexados aos deoxynucleosidetriphosphates regulares (dNTPs). O terminal obstrui a extensão da corrente do ADN.
Contudo, os terminais são reversíveis, assim que após o readout, o terminal é removido e uma outra base é adicionada à corrente. O ciclo é repetido então para o comprimento lido completo do fragmento.
Detecção
Em Sanger que arranja em seqüência, as correntes terminadas são separadas em um gel de polyacrylamide. As primeiras demão (dNTPs) são etiquetadas com um isótopo radioactivo, ou, mais comumente, uma etiqueta fluorescente. A seqüência é lida então para fora de uma vez. Com detecção da fluorescência, quatro cores fluorescentes diferentes são usadas para distinguir as bases diferentes.
Para Illumina que arranja em seqüência, a detecção é realizada usando uma etiqueta fluorescente ligou o dNTP. Uma única tintura fluorescente é usada para todas as bases, e cada dNTP é adicionado separada para distingui-las de um outro.
Rendimento da seqüência do ADN
A diferença prática preliminar entre Sanger que arranja em seqüência e arranjar em seqüência da próxima geração é o rendimento de dados da seqüência.
A máquina arranjando em seqüência de Illumina pode produzir até 20 bases mega (Mb) pela hora com um comprimento lido de 100 bases de ambas as extremidades do molde. Arranjar em seqüência de Sanger do gel da laje produz 0,0672 Mb/hr com um comprimento lido de 700 bp.
Custo
O custo relativo de arranjar em seqüência de Sanger é mais alto do que NGS. Arranjar em seqüência de Sanger é calculado aproximadamente $500 por 1000 bases, comparadas a menos de $0,50 por 1000 bases para NGS, de acordo com um estudo 2011.
Quando usar arranjar em seqüência de Sanger
A próxima geração que arranja em seqüência a tecnologia é agora com certeza trabalhos preferidos. Aqueles incluem:
- arranjando em seqüência mais de 100 genes simultaneamente
- expandindo o número de alvos para encontrar variações novas
- amostras com baixas quantidades da entrada de material começar
- genomas microbianos para o micróbio patogénico que subtyping em situações críticas da manifestação
Arranjar em seqüência de Sanger é ainda uma boa escolha quando:
- arranjando em seqüência únicos genes
- Arranjar em seqüência o amplicon visa até 100 pares baixos
- arranjando em seqüência 96 amostras ou menos
- identificação dos micróbios
- analisando fragmentos
- analisando repetições em tandem curtos (STRs)
Fontes
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