Actualmente, los dos métodos más populares de secuencia de la DNA son Sanger que ordena y secuencia de la generación siguiente (NGS). Mientras que NGS ha alcanzado en gran parte Sanger que ordenaba, todavía es utilizado por los investigadores hoy debido a su simplicidad y facilidad de empleo.
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La secuencia de Sanger fue desarrollada en los años 70 por Frederick Sanger y era la DNA original que ordenaba método.
En la secuencia de Sanger, cadena-terminando el nucleósido las bases se incorporan en la reacción de la réplica de la DNA. Esto resulta en una serie de las cadenas de la DNA truncadas en cada par bajo en la serie. La serie entonces es leída separando estas cadenas en un gel de poliacrilamida.
La generación siguiente es un más nuevo método que se puede utilizar para ordenar pedazos mucho más grandes de DNA, o aún genomas enteros. Se basa en la secuencia durante la reacción de la síntesis de la DNA. La reacción se realiza en una superficie fija. Cada vez que se agrega una base, se lee la nueva información de la serie. Los millares de reacciones se pueden ordenar simultáneamente.
Illumina
La siguiente-generación dominante que ordena la plataforma es Illumina. Fue desarrollada originalmente por la compañía Solexa basado en una tecnología del arsenal, amplificación del puente, de Pascal Meyer y otros, antes de ser perfeccionado sobre por los científicos de Solexa. Esta tecnología fue detectada por Illumina en 2007.
El método de Illumina tiene un concepto similar a la secuencia de Sanger. En la secuencia de Sanger, cadena-terminando los di-deoxynucleosidetriphosphates (ddNTPs) se incorporan en cadenas de la DNA durante la réplica de la DNA usando la DNA del patrón y una pintura de fondo para comenzar la reacción.
En Illumina que ordena, los adaptadores reversibles se sujetan a los deoxynucleosidetriphosphates regulares (dNTPs). El adaptador ciega la extensión de la cadena de la DNA.
Sin embargo, los adaptadores son reversibles, así que después de lectura, se quita el adaptador y otra base se agrega a la cadena. El ciclo entonces se relanza para el largo leído completo del fragmento.
Detección
En Sanger que ordena, las cadenas terminadas se separan en un gel de poliacrilamida. Las pinturas de fondo (dNTPs) etiqueta con un isótopo radioactivo, o, generalmente, una escritura de la etiqueta fluorescente. Entonces se lee la serie de una vez. Con la detección de la fluorescencia, cuatro diversos colores fluorescentes se utilizan para distinguir las diversas bases.
Para Illumina que ordena, la detección se realiza usando una escritura de la etiqueta fluorescente pegó el dNTP. Un único tinte fluorescente se utiliza para todas las bases, y cada dNTP se agrega por separado para distinguirlas a partir del uno otro.
Rendimiento de la serie de la DNA
La diferencia práctica primaria entre Sanger que ordena y secuencia de la generación siguiente es el rendimiento de datos de la serie.
La máquina de secuencia de Illumina puede producir hasta 20 bases mega (Mb) por hora con un largo leído de 100 bases de ambos extremos del patrón. La secuencia de Sanger del gel de la plancha produce 0,0672 Mb/hr con un largo leído del punto de ebullición 700.
Costo
El costo relativo de secuencia de Sanger es más alto que NGS. La secuencia de Sanger se estima aproximadamente $500 por 1000 bases, comparadas a menos de $0,50 por 1000 bases para NGS, según un estudio 2011.
Cuándo utilizar la secuencia de Sanger
La generación siguiente que ordena tecnología ahora es con certeza trabajos preferidos. Ésos incluyen:
- ordenando más de 100 genes simultáneamente
- desplegar el número de objetivos para encontrar variantes nuevas
- muestras con cantidades inferiores de la entrada de materia prima
- genomas microbianos para el patógeno subtyping en situaciones críticas del brote
La secuencia de Sanger sigue siendo una buena opción cuando:
- secuencia de únicos genes
- La secuencia del amplicon apunta hasta 100 pares bajos
- secuencia de 96 muestras o menos
- el determinar de microbios
- analizar fragmentos
- analizar repeticiones en tándem cortas (STRs)
Fuentes
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