Separando Flavinoids dalle proteine del plasma facendo uso di UHPLC-MS

I flavonoidi dell'impianto sono stati indicati per avere un effetto positivo sulle sanità, ma i loro effetti fisiologici e prodotti metabolici rimangono capiti male. Una ragione per questa è che non appena i flavonoidi raggiungono il sangue, legano prontamente alle proteine del plasma e devono essere liberati prima dell'analisi.

Gli scienziati hanno descritto un metodo per separare ed analizzare i flavonoidi digerendo le proteine del plasma con gli enzimi della proteasi. Il metodo ha fornito i buoni ripristini una volta provato a flavonoide quercetin-3-O-glucuronide (Q3GlcA) e permesso la quantificazione del flavonoide da cromatografia a fase mobile liquida di pressione ultraelevata si è accoppiato a spettrometria di massa in tandem (UHPLC-MSn).

I flavinoids dellMicrogen | Shutterstock

I flavonoidi sono metaboliti secondari fenolici comuni in piante superiori. È ben noto che prendiamo i flavonoidi con la nostra dieta quotidiana dalle sorgenti di verdure e la ricerca ha suggerito l'attività antiossidante ed anticancro dei flavonoidi con gli effetti attenuarsi sulle malattie cardiovascolari. Tuttavia, poiché i flavonoidi saranno trasformati in nostro apparato digerente, è capito insufficientemente se i flavonoidi, o i loro prodotti metabolici abbiano un effetto con pertinenza fisiologica.

Passando il tratto gastrointestinale, i flavonoidi o i prodotti metabolici sono assorbiti nella circolazione sanguigna, in cui legano prontamente con le proteine del plasma sanguigno. Ciò fa l'analisi dei flavonoidi nel sangue che sfida, con i metodi quale cromatografia a fase mobile liquida, poiché le proteine devono essere eliminate dal campione senza simultaneamente eliminare i flavonoidi legati alle proteine.

I metodi precedenti dell'estrazione della proteina hanno usato l'estrazione o (SPE) l'estrazione liquido-liquido in fase solida (LLE), due metodi comuni per il preparato del campione per cromatografia a fase mobile liquida. Mentre questi metodi sono efficienti nella rimozione della proteina, i ripristini flavonoidi non sono stati ben documentati.

Nello studio presente, piombo dal professor Andreas Schieber e dal Dott. Maike Passon, ricercatori al dipartimento delle scienze dell'alimentazione e nutrizionali all'università di Bonn (Germania) ora hanno dimostrato che il flavonoide - il glucuronide (Q3GlcA) può essere recuperato dal plasma sanguigno degradando le proteine del plasma con gli enzimi della proteasi. Con estrazione liquido-liquido successiva (LLE), i campioni flavonoidi erano adatti ad analisi di cromatografia a fase mobile liquida.

La digestione della proteasi rilascia i flavonoidi per UHPLC-MSn

I ricercatori hanno dissolto il flavonoide Q3GlcA nel plasma sanguigno umano ad una concentrazione conosciuta ed hanno aggiunto le proteasi differenti. Dopo 20 ore di digestione della proteasi, i frammenti risultanti del peptide sono stati precipitati tramite l'aggiunta del solvente organico, lasciante i flavonoidi liberi in soluzione. I flavonoidi poi sono stati analizzati da UHPLC-MSn forniti di spettrometro di massa della trappola lineare dello ione, con 6,3 minuti ammontano al tempo di misura.

I ricercatori hanno convalidato il loro metodon di UHPLC-MS secondo le linee guida dell'agenzia per l'ambiente federale tedesca (GFEA) e degli Stati Uniti Food and Drug Administration (Stati Uniti FDA), come richiesto per i metodi di controllo (QC) di qualità standard.

Il metodo ha mostrato un buon ripristino dei flavinoids

La pepsina della proteasi, un reagente comune di biologia molecolare, ha rilasciato efficientemente il flavonoide Q3GlcA dal plasma sanguigno. Con la digestione della pepsina, Q3GlcA ha potuto essere quantificato con l'alta sensibilità, anche ad una concentrazione inferiore a 10 ng/ml.

Per il confronto, in uno studio precedente, le concentrazioni flavonoidi considerevolmente più alte erano state osservate nel plasma sanguigno, dimostrante che questo nuovo metodo sarà appropriato per lo studio dei livelli flavonoidi fisiologici in nutrizione studia.

Le tariffe di ripristino di Q3GlcA erano 67 +/- 16% ed il metodo analitico ha avuto un coefficiente di variazione di 24%. Mentre gli autori hanno notato che questi valori non erano ancora soddisfacenti rispetto alle linee guida degli Stati Uniti FDA (>70% e <15%, rispettivamente), i miglioramenti possono essere apportati ottimizzando il metodo flavonoide dell'estrazione dopo il punto di digestione della proteasi.

Che cosa circa altri flavonoidi?

La digestione della proteasi era efficiente per Q3GlcA di misura nel plasma sanguigno da UHPLC-MSn, sebbene ulteriori miglioramenti fossero richiesti per rendere questo metodo analitico soddisfacente rispetto alle linee guida regolarici. Ulteriore ricerca ora dovrà provare se il metodo di digestione della proteasi può anche essere utilizzato per l'analisi di altri composti flavonoidi nel plasma sanguigno.

La ricerca è stata pubblicata nell'edizione del giugno 2019 del giornale della chimica agricola ed alimentare.

Sorgente

Kaiser m. et al., un approccio innovatore al preparato dei campioni del plasma per analisi di UHPLC−MS. Alimento Chem 2019, 67, 23, 6665-6671 di J Agric; DOI: 10.1021/acs.jafc.9b01782.

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Last Updated: Jul 18, 2019

Christian Zerfaß, Ph.D.

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Christian Zerfaß, Ph.D.

Christian is an enthusiastic life scientist who wants to understand the world around us. He was awarded a Ph.D. in Protein Biochemistry from Johannes Gutenberg University in Mainz, Germany, in 2015, after which he moved to Warwick University in the UK to become a post-doctoral researcher in Synthetic Biology.

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