Separando Flavinoids das proteínas do plasma usando UHPLC-MS

As flavonóides da planta foram mostradas para ter um efeito positivo na saúde humana, mas seus efeitos fisiológicos e produtos metabólicos permanecem compreendidos deficientemente. Uma razão para esta é que assim que as flavonóides alcançarem o sangue, ligam prontamente às proteínas do plasma e precisam de ser liberadas antes da análise.

Os cientistas descreveram um método para separar e analisar flavonóides digerindo proteínas do plasma com enzimas do protease. O método forneceu boas recuperações quando testado para a flavonóides quercetin-3-O-glucuronide (Q3GlcA) e permitido a quantificação da flavonóides pela cromatografia líquida da pressão ultra-alta acoplou-se à espectrometria em massa em tandem (UHPLC-MSn).

Os flavinoids da planta podem ser encontrados em tabuletas de vitamina.Microgen | Shutterstock

As flavonóides são metabolitos secundários fenólicos comuns em umas plantas mais altas. É conhecido que nós pegamos flavonóides com nossa dieta diária das fontes vegetais, e a pesquisa sugeriu a actividade antioxidante e anticancerosa das flavonóides junto com efeitos do abrandamento em doenças cardiovasculares. Contudo, desde que as flavonóides serão processadas em nosso tracto digestivo, compreende-se insuficiente se as flavonóides, ou seus produtos metabólicos têm um efeito com importância fisiológico.

Passando o aparelho gastrointestinal, as flavonóides ou os produtos metabólicos são absorvidos na circulação sanguínea, onde ligam prontamente com proteínas do plasma de sangue. Isto faz a análise das flavonóides no sangue que desafia, com métodos tais como a cromatografia líquida, desde que as proteínas têm que ser removidas da amostra sem simultaneamente remover as flavonóides do proteína-limite.

Os métodos precedentes da extracção da proteína usaram a extracção da contínuo-fase (SPE) ou a extracção do líquido-líquido (LLE), dois métodos comuns para a preparação da amostra para a cromatografia líquida. Quando estes métodos forem eficientes na remoção da proteína, as recuperações da flavonóides não foram bem documentados.

No estudo actual, conduzido pelo professor Andreas Schieber e pelo Dr. Maike Passon, pesquisadores no departamento de nutritivo e ciências alimentares na universidade de Bona (Alemanha) têm demonstrado agora que a flavonóides - o glucuronide (Q3GlcA) pode ser recuperado do plasma de sangue degradando as proteínas do plasma com as enzimas do protease. Com extracção subseqüente do líquido-líquido (LLE), as amostras da flavonóides eram apropriadas para a análise da cromatografia líquida.

A digestão do Protease libera flavonóides para UHPLC-MSn

Os pesquisadores dissolveram a flavonóides Q3GlcA no plasma de sangue humano em uma concentração conhecida e adicionaram proteases diferentes. Após 20 horas da digestão do protease, os fragmentos resultantes do peptide foram precipitados pela adição de solvente orgânico, deixando flavonóides livres na solução. As flavonóides foram analisadas então por UHPLC-MSn equipadas com um espectrómetro em massa da armadilha linear do íon, com 6,3 minutos totalizam o tempo da medida.

Os investigador validaram seu métodon de UHPLC-MS de acordo com as directrizes da agência ambiental federal alemão (GFEA) e dos Estados Unidos Food and Drug Administration (E.U. FDA), como necessário para o padrão - métodos do controle da qualidade (QC).

O método mostrou uma boa recuperação dos flavinoids

O pepsina do protease, um reagente comum da biologia molecular, liberou eficientemente a flavonóides Q3GlcA do plasma de sangue. Com a digestão do pepsina, Q3GlcA podia ser determinado com sensibilidade alta, mesmo em uma concentração abaixo de 10 ng/ml.

Para a comparação, em um estudo precedente, umas concentrações consideravelmente mais altas da flavonóides tinham sido observadas no plasma de sangue, demonstrando que este método novo será apropriado para investigar níveis fisiológicos da flavonóides na nutrição estuda.

As taxas de recuperação de Q3GlcA eram 67 +/- 16%, e o método analítico teve um coeficiente de variação de 24%. Quando os autores notaram que estes valores não eram ainda complacentes com as directrizes dos E.U. FDA (>70% e <15%, respectivamente), as melhorias podem ser feitas aperfeiçoando o método da extracção da flavonóides após a etapa da digestão do protease.

Que sobre outras flavonóides?

A digestão do protease era eficiente para Q3GlcA de determinação no plasma de sangue por UHPLC-MSn, embora umas melhorias mais adicionais fossem exigidas para fazer este método analítico complacente com directrizes reguladoras. Uma pesquisa mais adicional precisará agora de testar se o método da digestão do protease pode igualmente ser usado para a análise de outros compostos da flavonóides no plasma de sangue.

A pesquisa foi publicada na introdução de junho de 2019 do jornal da química agrícola e de alimento.

Source

Kaiser M e outros, uma aproximação inovativa à preparação de amostras do plasma para a análise de UHPLC−MS. Alimento Chem 2019 de J Agric, 67, 23, 6665-6671; DOI: 10.1021/acs.jafc.9b01782.

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Last Updated: Jul 18, 2019

Christian Zerfaß, Ph.D.

Written by

Christian Zerfaß, Ph.D.

Christian is an enthusiastic life scientist who wants to understand the world around us. He was awarded a Ph.D. in Protein Biochemistry from Johannes Gutenberg University in Mainz, Germany, in 2015, after which he moved to Warwick University in the UK to become a post-doctoral researcher in Synthetic Biology.

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