Separación de Flavinoids de las proteínas del plasma usando UHPLC-MS

Los flavonoides de la instalación se han mostrado para tener un efecto positivo sobre salud humana, pero sus efectos fisiológicos y productos metabólicos siguen siendo mal entendidos. Una razón de esto es que tan pronto como los flavonoides alcancen la sangre, atan fácilmente a las proteínas del plasma y necesitan ser liberados antes de análisis.

Los científicos han descrito un método para separar y para analizar los flavonoides digiriendo las proteínas del plasma con las enzimas de la proteasa. El método ofreció buenas recuperaciones cuando estaba probado para el flavonoide quercetin-3-O-glucuronide (Q3GlcA) y permitido la cuantificación del flavonoide por cromatografía líquida de la presión ultraalta acopló a la espectrometría de masa en tándem (UHPLC-MSn).

Los flavinoids de la instalación se pueden encontrar en tablillas de vitamina.Microgen | Shutterstock

Los flavonoides son metabilitos secundarios fenólicos comunes en instalaciones más altas. Es bien sabido que tomamos los flavonoides con nuestra dieta diaria de las fuentes vegetales, y la investigación ha sugerido la actividad antioxidante y anticáncer de flavonoides junto con efectos de la atenuación sobre enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, puesto que los flavonoides serán tramitados en nuestro aparato digestivo, se entiende escaso si los flavonoides, o sus productos metabólicos tienen un efecto con importancia fisiológica.

Pasando el aparato gastrointestinal, los flavonoides o los productos metabólicos se absorben en la circulación sanguínea, donde atan fácilmente con las proteínas del plasma de sangre. Esto hace el análisis de flavonoides en la sangre que desafía, con métodos tales como cromatografía líquida, puesto que las proteínas tienen que ser quitadas de la muestra sin simultáneamente la eliminación de los flavonoides del proteína-salto.

Los métodos anteriores de la extracción de la proteína han utilizado la extracción o (SPE) la extracción de dos líquidos, (LLE) dos métodos comunes de la sólido-fase para la preparación de la muestra para la cromatografía líquida. Mientras que estos métodos son eficientes en retiro de la proteína, las recuperaciones flavonoides no han estado bien documentadas.

En el actual estudio, llevado por profesor Andreas Schieber y el Dr. Maike Passon, investigadores en el departamento de las ciencias alimenticias y de la alimentación en la universidad de Bonn (Alemania) ahora han demostrado que el flavonoide - el glucuronide (Q3GlcA) se puede recuperar de plasma de sangre degradando las proteínas del plasma con las enzimas de la proteasa. Con la extracción de dos líquidos subsiguiente (LLE), las muestras flavonoides eran convenientes para el análisis de la cromatografía líquida.

La digestión de la proteasa libera los flavonoides para UHPLC-MSn

Los investigadores disolvieron el flavonoide Q3GlcA en plasma de sangre humana en una concentración sabida y agregaron diversas proteasas. Después de 20 horas de digestión de la proteasa, los fragmentos resultantes del péptido fueron precipitados por la adición del disolvente orgánico, dejando los flavonoides libres en la solución. Los flavonoides entonces eran analizados por UHPLC-MSn equipados de un espectrómetro de masas lineal de la trampa del ión, con 6,3 minutos suman tiempo de la medición.

Los investigadores validaron su métodon de UHPLC-MS según las pautas de la dependencia ambiental federal alemana (GFEA) y de los Estados Unidos Food and Drug Administration (los E.E.U.U. FDA), como sea necesario para los métodos de control (QC) de calidad standard.

El método mostró una buena recuperación de flavinoids

La pepsina de la proteasa, un reactivo común de la biología molecular, liberó eficientemente el flavonoide Q3GlcA del plasma de sangre. Con la digestión de la pepsina, Q3GlcA se podía cuantificar con alta sensibilidad, incluso en una concentración abajo de 10 ng/ml.

Para la comparación, en un estudio precedente, concentraciones flavonoides considerablemente más altas habían sido observadas en el plasma de sangre, demostrando que este nuevo método será apropiado para investigar niveles flavonoides fisiológicos en nutrición estudia.

Los regímenes de recuperación de Q3GlcA eran 67 los +/- 16%, y el método analítico tenía un coeficiente de variación del 24%. Mientras que los autores observaron que estos valores no eran todavía obedientes con las pautas de los E.E.U.U. FDA (el >70% y el <15%, respectivamente), mejoras pueden ser llevadas a cabo optimizando el método flavonoide de la extracción después del paso de la digestión de la proteasa.

¿Qué sobre otros flavonoides?

La digestión de la proteasa era eficiente para Q3GlcA de cuantificación en plasma de sangre por UHPLC-MSn, aunque otras mejorías se requieran para hacer este método analítico obediente con las pautas reguladoras. La investigación adicional ahora necesitará probar si el método de la digestión de la proteasa se pueda también utilizar para el análisis de otras composiciones flavonoides en plasma de sangre.

La investigación fue publicada en la aplicación de junio de 2019 el gorrón de la química alimenticia agrícola y.

Fuente

Kaiser M y otros, una aproximación innovadora a la preparación de las muestras del plasma para el análisis de UHPLC−MS. Comida Chem 2019, 67, 23, 6665-6671 de J Agric; DOI: 10.1021/acs.jafc.9b01782.

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Last Updated: Jul 18, 2019

Christian Zerfaß, Ph.D.

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Christian Zerfaß, Ph.D.

Christian is an enthusiastic life scientist who wants to understand the world around us. He was awarded a Ph.D. in Protein Biochemistry from Johannes Gutenberg University in Mainz, Germany, in 2015, after which he moved to Warwick University in the UK to become a post-doctoral researcher in Synthetic Biology.

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