Étudiant des ARNm, ou le transcriptome, peut fournir des informations importantes sur la façon dont les gènes fonctionnent dans un organisme.
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L'expression du gène se rapporte à la traduction d'information d'indicatif d'ADN à une protéine fonctionnelle. L'intermédiaire pour cette conversion est ARN messager, ou ARNm. Des gènes sont transcrits en ARNm, et l'ARNm est employé par le ribosome pour établir une protéine.
L'analyse séquentielle de l'expression du gène (SAUGE) emploie l'ARNm d'un échantillon particulier pour produire les éclats de l'ADN complémentaire (ADNc) qui sont alors amplifiés et ordonnancés utilisant le haut-débit ordonnançant la technologie.
Le mécanisme derrière la SAUGE est basé sur les balises qui peuvent recenser la transcription originelle, et l'ordonnancement rapide des réseaux des balises jointes ensemble. La procédure simplifie essentiellement l'ordonnancement en joignant les segments d'ADNc ensemble dans une longue chaîne.
L'analyse donnante droit donne un instantané du transcriptome de l'échantillon, y compris l'identité et l'abondance de chaque ARNm.
Opérations de SAUGE
La SAUGE est un protocole complexe avec beaucoup d'opérations.
- Étape 1 : l'ARNm est isolé dans l'échantillon et l'inverse transcrits utilisant les amorces biotinylated pour produire de l'ADNc
- Étape 2 : l'ADNc est lié par l'intermédiaire de la biotine aux microbeads de streptavidin
- Étape 3 : l'ADNc est fendu avec des enzymes de restriction la libérant des talons
- Étape 4 : L'ADN fendu est effacé, laissant l'ADNc tronqué lié aux talons
- Étape 5 : Deux oligonucléotides avec les extrémités cohésives sont ajoutés à l'autre ADNc tronqué, dans les échantillons indépendants
- Étape 6 : L'ADN fendu « est étiqueté » enzymatiquement, la retirant des talons
- Étape 7 : Des extrémités cohésives sont réparées avec de l'ADN polymérase
- Étape 8 : Des balises extrémité franches des deux échantillons indépendants sont ligaturées ensemble, produisant des ditags avec deux extrémités différentes d'adaptateur d'oligonucléotide
- Étape 9 : Ditags sont fendus pour éliminer les oligonucléotides. Ditags formera de longs réseaux d'ADNc, ou concatémères
- Étape 10 : Transformez les concatémères en bactéries pour la réplication
- Étape 11 : Concatémères d'isolat des bactéries et de séquence
Défis en employant la SAUGE
Un défi est que les balises sont seulement les environ 13 ou 14 paires de bases. Il peut être difficile de recenser une balise si courte s'il est d'un gène inconnu.
Le revers de ce problème est que la SAUGE peut être employée pour trouver les gènes inconnus, et dans quelques études c'est un avantage à pouvoir mesurer l'expression du gène quantitativement sans information préalable de séquence.
Les balises peuvent également avoir des éditions avec la spécificité ; les familles multigéniques pourraient partager la même balise s'il y a une superposition dans l'ordre. Il peut également y avoir des incohérences avec des enzymes de restriction, et des incompatibilités pour certaines espèces.
Puce ADN de SAUGE et d'ADN
La SAUGE est assimilée de plusieurs manières à une puce ADN d'ADN ; cependant, dans une puce ADN d'ADN, les ARNm hybrident aux sondes d'ADNc sur le choix. En SAUGE, la sortie de caractéristiques est basée sur l'ordonnancement. Cela signifie que l'analyse SAGE est plus quantitative et elle ne dépend pas de l'utilisation des gènes connus.
Les expériences de puce ADN sont généralement moins coûteuses, et ainsi sont employées plus souvent dans des études à plus grande échelle.
Application
Une étude des bornes neuves dans le cancer illustre comment la SAUGE peut être employée dans la recherche biomédicale.
L'expression du gène comparée de chercheurs nivelle en tissus cancéreux avec ceux en tissus non-cancéreux pour rechercher les bornes qui pourraient diagnostiquer le cancer pancréatique à un stade précoce.
Puisque les résultats d'une analyse SAGE d'un grand nombre de tissus représentatifs avaient déjà été en ligne publié, les scientifiques pouvaient rechercher la base de données des gènes préférentiellement exprimés en cancer pancréatique.
De ceci, ils pouvaient recenser un antigène de cellule souche de calledprostate de gène (PCSA), qui n'avait pas été précédemment associé au cancer pancréatique.
Sources :
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