Estudando mRNAs, ou o transcriptome, pode render a informação importante sobre como os genes trabalham em um organismo.
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A expressão genética refere a tradução de informação do código do ADN a uma proteína funcional. O intermediário para essa conversão é RNA de mensageiro, ou mRNA. Os genes são transcritos no mRNA, e o mRNA é usado pelo ribosome para construir uma proteína.
A análise de série da expressão genética (SÁBIO) usa o mRNA de uma amostra particular para criar os fragmentos complementares do ADN (cDNA) que então são amplificados e arranjados em seqüência usando a alto-produção que arranja em seqüência a tecnologia.
O mecanismo atrás do SÁBIO é baseado nas etiquetas que podem identificar o transcrito original, e em arranjar em seqüência rápido das correntes das etiquetas ligadas junto. O procedimento simplifica essencialmente arranjar em seqüência ligando os segmentos do cDNA junto em uma corrente longa.
A análise resultante dá um instantâneo do transcriptome da amostra, incluindo a identidade e a abundância de cada mRNA.
Etapas do SÁBIO
O SÁBIO é um protocolo complexo com muitas etapas.
- Etapa 1: o mRNA é isolado da amostra e do reverso transcritos usando primeiras demão biotinylated para gerar o cDNA
- Etapa 2: o cDNA é limitado através da biotina aos microbeads do streptavidin
- Etapa 3: o cDNA é fendido com as enzimas da limitação que livram a dos grânulos
- Etapa 4: O ADN fendido é lavado para fora, saindo do cDNA truncado limitado aos grânulos
- Etapa 5: Dois oligonucleotides com extremidades pegajosas são adicionados ao cDNA truncado permanecendo, em amostras separadas
- Etapa 6: O ADN fendido “é etiquetado” enzymatically, removendo a dos grânulos
- Etapa 7: As extremidades pegajosas são reparadas com polimerase de ADN
- Etapa 8: As etiquetas terminadas sem corte das duas amostras separadas são ligadas junto, gerando ditags com as duas extremidades diferentes do adaptador do oligonucleotide
- Etapa 9: Ditags é fendido para remover os oligonucleotides. Ditags formará correntes longas do cDNA, ou concatemers
- Etapa 10: Transforme concatemers nas bactérias para a réplica
- Etapa 11: Concatemers do isolado das bactérias e da seqüência
Desafios ao usar o SÁBIO
Um desafio é que as etiquetas são somente aproximadamente 13 ou 14 pares baixos. Pode ser difícil identificar uma etiqueta tão curto se é de um gene desconhecido.
Outros lado desse problema são que o SÁBIO pode ser usado para encontrar genes desconhecidos, e em alguns estudos é uma vantagem a poder medir quantitativa a expressão genética sem informação prévia da seqüência.
As etiquetas podem igualmente ter edições com especificidade; os genes múltiplos poderiam compartilhar da mesma etiqueta se há uma sobreposição em ordem. Igualmente pode haver umas inconsistências com as enzimas da limitação, e umas espécies das incompatibilidades com certeza.
Microarray do SÁBIO e do ADN
O SÁBIO é similar de várias maneiras a um microarray do ADN; contudo, em um microarray do ADN, os mRNAs cruzam às pontas de prova do cDNA na disposição. No SÁBIO, a saída de dados é baseada em arranjar em seqüência. Isso significa que a análise PRUDENTE é mais quantitativa e não depende do uso de genes conhecidos.
As experiências do Microarray são geralmente menos caras, e assim que são usadas mais frequentemente em estudos em maior escala.
Aplicação
Um estudo de marcadores novos no cancro ilustra como o SÁBIO pode ser usado na pesquisa biomedicável.
Os pesquisadores compararam níveis da expressão genética em tecidos cancerígenos com os aqueles em tecidos não-cancerígenos para procurarar pelos marcadores que poderiam diagnosticar o cancro do pâncreas em uma fase inicial.
Porque os resultados de uma análise PRUDENTE de um grande número tecidos representativos tinham sido publicados já em linha, os cientistas podiam procurarar a base de dados pelos genes expressados preferencial no cancro do pâncreas.
Disto, podiam identificar um antígeno da célula estaminal do calledprostate do gene (PCSA), que não fosse associado previamente com o cancro do pâncreas.
Fontes:
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