Estudiando los mRNAs, o el transcriptome, puede rendir la información importante sobre cómo los genes trabajan en un organismo.
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La expresión génica refiere a la traslación de la información de la clave de la DNA a una proteína funcional. El intermediario para esa conversión es ARN de mensajero, o mRNA. Los genes se transcriben en el mRNA, y el mRNA es utilizado por el ribosoma para construir una proteína.
El análisis serial de la expresión génica (SABIO) utiliza el mRNA de una muestra determinada para crear los fragmentos complementarios de la DNA (cDNA) que después se amplifican y se ordenan usando la alto-producción que ordena tecnología.
El mecanismo detrás del SABIO se basa en las etiquetas que pueden determinar la transcripción original, y la secuencia rápida de cadenas de las etiquetas conectadas juntas. El procedimiento esencialmente simplifica la secuencia conectando los segmentos del cDNA juntos en una cadena larga.
El análisis resultante da una foto del transcriptome de la muestra, incluyendo la identidad y la abundancia de cada mRNA.
Pasos del SABIO
El SABIO es un protocolo complejo con muchos pasos.
- Paso 1: el mRNA se aísla de la muestra y de la marcha atrás transcritas usando las pinturas de fondo biotinylated para generar el cDNA
- Paso 2: el cDNA está limitado vía la biotina a los microbeads del streptavidin
- Paso 3: el cDNA se hiende con las enzimas de la restricción que lo liberan de las molduras
- Paso 4: La DNA hendida se elimina, saliendo del cDNA truncado limitado a las molduras
- Paso 5: Dos oligonucleótidos con los extremos pegajosos se agregan al cDNA truncado restante, en muestras separadas
- Paso 6: La DNA hendida “se marca con etiqueta” enzimático, quitándolo de las molduras
- Paso 7: Los extremos pegajosos se reparan con la polimerasa de DNA
- Paso 8: Las etiquetas terminadas embotadas de las dos muestras separadas se ligan juntas, generando ditags con dos diversos extremos del adaptador del oligonucleótido
- Paso 9: Ditags se hiende para quitar los oligonucleótidos. Ditags formará cadenas largas del cDNA, o concatenameros
- Paso 10: Transforme los concatenameros en las bacterias para la réplica
- Paso 11: Concatenameros del aislante de bacterias y de la serie
Retos al usar el SABIO
Un reto es que las etiquetas son solamente cerca de 13 o 14 pares bajos. Puede ser difícil determinar una etiqueta tan corta si es de un gen desconocido.
La parte negativa de ese problema es que el SABIO se puede utilizar para encontrar genes desconocidos, y en algunos estudios es una ventaja a poder medir la expresión génica cuantitativo sin la información anterior de la serie.
Las etiquetas pueden también tener entregas con especificidad; los genes múltiples podrían compartir la misma etiqueta si hay un recubrimiento en orden. También puede haber inconsistencias con las enzimas de la restricción, y especies de las incompatibilidades con certeza.
Microarray del SABIO y de la DNA
El SABIO es similar en gran medida a un microarray de la DNA; sin embargo, en un microarray de la DNA, los mRNAs cruzan por hibridación a las antenas del cDNA en el arsenal. En SABIO, el rendimiento de datos se basa en la secuencia. Eso significa que el análisis SABIO es más cuantitativo y no depende del uso de genes sabidos.
Los experimentos del Microarray son generalmente menos costosos, y así que se utilizan más a menudo en estudios a mayor escala.
Uso
Un estudio de nuevos marcadores en cáncer ilustra cómo el SABIO se puede utilizar en la investigación biomédica.
Los investigadores compararon niveles de la expresión génica en tejidos cacerígenos con ésos en tejidos no-cacerígenos para explorar para los marcadores que podrían diagnosticar el cáncer pancreático en un primero tiempo.
Porque los resultados de un análisis SABIO de un gran número de tejidos representativos habían sido publicados ya en línea, los científicos podían explorar la base de datos para los genes expresados preferencial en cáncer pancreático.
De esto, podían determinar un antígeno de la célula madre del calledprostate del gen (PCSA), que no había sido asociado previamente al cáncer pancreático.
Fuentes:
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