Attenzione: questa pagina è una traduzione automatica di questa pagina originariamente in lingua inglese. Si prega di notare in quanto le traduzioni sono generate da macchine, non tutte le traduzioni saranno perfetti. Questo sito web e le sue pagine web sono destinati ad essere letto in inglese. Ogni traduzione del sito e le sue pagine web possono essere imprecise e inesatte, in tutto o in parte. Questa traduzione è fornita per comodità.

Singola microscopia di localizzazione della molecola

Da Anusha Krishnan, PhD

La singola microscopia della localizzazione della molecola (SMLM) è classe A di tecniche di microscopia di super-risoluzione usate per ottenere le immagini ottiche alle risoluzioni spaziali molto alte che variano fra 2-25 nanometri.

Credito: Micha Weber/Shutterstock.com

Nell'ultima decade, gli avanzamenti rapidi nelle metodologie di SMLM hanno permesso che gli scienziati osservassero i trattamenti intracellulari - quale il movimento di miosina V attraverso i filamenti dell'actina, i singoli eventi della trascrizione del mRNA e la dinamica del endocytosis virale - che era una volta probabilmente impossible da visualizzare.

Cronologia di SMLM

La microscopia di super-risoluzione è stata scoperta verso la conclusione del secoloth 19. Prima di questo, risolvendo due oggetti microscopici si è situato più vicino ad a vicenda che la metà della lunghezza d'onda di indicatore luminoso era comunemente probabilmente impossibile.

Ciò è “il limite di abbe„ o “limite di diffrazione„ per microscopia dovuto quale scienziati non potrebbero prevedere chiaramente le strutture più piccole di 200 nanometro (metà della lunghezza d'onda di indicatore luminoso blu lontano, che ha una lunghezza d'onda di 400nm).

Nel 2014, William Moerner, inferno di Stefan ed Eric Betzig hanno ricevuto il premio Nobel in chimica per sviluppare i tipi radicali adi microscopies basati a fluorescenza che potrebbero fornire la risoluzione molto al di là di quelle imposte dal limite delle abbe.

Mentre l'inferno di Stefan ha sviluppato la microscopia di fluorescenza di STED (svuotamento dell'emissione stimolata), il lavoro di Betzig e di Moerner ha gettato indipendente le basi di singola microscopia della molecola.

Principi di SMLM

la microscopia di Super-risoluzione è basata sulla conoscenza che la posizione di singolo fluorophore può essere individuata molto più precisamente dell'intervallo di ~200 nanometro dettato dal limite di diffrazione.

La potenza di risoluzione di tutto il microscopio è determinata dalla lunghezza d'onda di indicatore luminoso usata e l'apertura diaframma numerica o l'indicatore luminoso che raccoglie l'abilità dell'obiettivo. dovuto questi due fattori, tutta la sorgente puntiforme di indicatore luminoso che è più piccolo del limite di diffrazione sembrerà essere confusa e più grande di realmente è.

Lo PSF (funzione di dispersione del punto) di uno strumento è una caratteristica che descrive questo “effetto del mosso„, o come un oggetto più piccolo del limite di diffrazione sembra nell'ambito di determinata rappresentazione condiziona. PSF è caratterizzato dalla misurazione della larghezza evidente di un oggetto fluorescente ad un punto in cui la sua intensità è 50% del massimo, chiamata il FWHM (di grande ampiezza al mezzo massimo).

Facendo uso di FWHM, la posizione di singola molecola fluorescente può essere ottenuta con una precisione bassa quanto 1 nanometro. Questa precisione pricipalmente è limitata dal numero dei fotoni raccolti ad ogni punto ed è equivalente al FWHM diviso dalla root quadrata del numero dei fotoni raccolti.

Sebbene prevedere singoli i fluorophores radi sia un metodo eccellente per impiegare quando studiando la dinamica delle molecole specifiche dell'obiettivo, non è molto utile nello studio dei sistemi biologici complessi che sono altamente ammucchiati e densi. Il tasto ad ottenere la super-risoluzione in tali sistemi è la separazione temporale di molecole attivamente stanti flourescenti, che costituisce la base di SMLM.

Tutte le tecniche di SMLM sono collegate per principio temporaneamente di modulazione dell'emissione di piccolo insieme dei fluorophores. Un raggio laser dell'basso intensità è utilizzato per attivare casualmente, localizza e reversibilmente o irreversibilmente candeggia alcuni fluorophores a qualsiasi momento dato; ripetendo questo trattamento molte migliaia di periodi fornisce delle le immagini ricche di dettaglio altamente risolte.

Tipi di SMLM

Le tecniche di SMLM pricipalmente differiscono nei tipi di fluorophores usati e nei metodi impiegati per gestire temporaneamente i reticoli dell'emissione di questi fluorophores.

PALMA (microscopia di localizzazione di PhotoActivated), FPALM (microscopia di localizzazione di PhotoActivated di fluorescenza) e TEMPESTA (microscopia ottica stocastica di ricostruzione)

Tutte e tre le tecniche usano la stessa metodologia dei fluorophores d'attivazione con un raggio laser ad alta intensità, seguente che un laser dell'basso intensità è utilizzato casualmente per eccitare la fluorescenza in un insieme rado dei fluorophores. Tuttavia, parecchie differenze fra queste tecniche esistono.

La PALMA e FPALM originalmente hanno usato le proteine quale PA-GFP (proteina fluorescente verde di PhotoActivatable) come fluorophores, mentre la TEMPESTA ha usato le tinture sintetiche Cy3 e Cy5 di carbocyanine.

Ancora, in PALMA e in FPALM, il fluorophore è espresso generalmente dalla cella come proteina di fusione etichettata alla proteina di interesse, mentre, gli elementi cellulari endogeni immunolabelled facendo uso degli anticorpi etichettati con i fluorophores in TEMPESTA. Tuttavia, è possibile utilizzare le tinture sintetiche negli esperimenti della PALMA e le proteine fluorescenti per gli esperimenti della TEMPESTA.

Oltre a queste differenze, la durata di un fluorophore è generalmente limitato dovuto l'attivazione mediante la luce ed i trattamenti photobleaching in PALMA e in FPALM.

In TEMPESTA, tuttavia, il fenomeno di photoblinking (dove le opzioni fluorophore a caso fra FUORI o lo stato scuro al SOPRA o emettendo stato nell'ambito dell'eccitazione continua) è utilizzato per la separazione temporale di attivazione della fluorescenza.

FPALM differisce dalla PALMA e la TEMPESTA nella tecnica di rappresentazione usata-FPALM usa la microscopia di fluorescenza confocale tradizionale, mentre la PALMA e la TEMPESTA utilizzano TIRFM (microscopia di fluorescenza totale del riflesso interno).

In TIRFM, nei fluorophores limitati alla superficie delle celle/tessuti in contatto con una lamella di vetro o nella parete del contenitore sono eccitati selettivamente; ciò diminuisce il numero dei fluorophores emozionanti nel campione, facente l'ideale di tecnica per singola rilevazione della molecola.  

FREDDO (localizzazione ottica criogenica in 3 dimensioni)

Il FREDDO, sviluppato nel 2016 cattura la microscopia di fluorescenza al suo limite fondamentale come dettato dalla dimensione del fluorophore. Il FREDDO permette la localizzazione sotto-molecolare dei siti fluorescenti multipli all'interno di singola molecola di proteina, fornente la risoluzione al livello dell'angstrom.

La tecnica usa le basse temperature per rallentare le reazioni fotochimiche nei fluorophores; ciò permette l'emissione di più alti numeri dei fotoni prima di photobleaching, quindi migliorando la precisione della localizzazione. Le 2 immagini dimensionali dei fluorophores possono essere usate per ricostruire 3 configurazioni dimensionali facendo uso degli algoritmi presi in prestito da microscopia elettronica.

Sorgenti:

Further Reading

Last Updated: May 29, 2018

Comments

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News Medical.