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Única microscopia de la localización de la molécula

Por Anusha Krishnan, doctorado

La única microscopia de la localización de la molécula (SMLM) es una clase de las técnicas de la microscopia de la estupendo-resolución usadas para obtener imágenes ópticas en las resoluciones espaciales muy altas que colocan entre 2-25 nanómetros.

Haber: Micha Weber/Shutterstock.com

En la década pasada, los avances rápidos en metodologías de SMLM han permitido que los científicos observen procesos intracelulares - tales como el movimiento de la miosina V a través de filamentos de la actinia, de únicas acciones de la transcripción del mRNA, y de las dinámicas del endocytosis viral - que eran una vez probablemente imposibles de visualizar.

Historia de SMLM

La microscopia de la estupendo-resolución fue descubierta hacia el final del sigloth 19. Antes de esto, resolviendo dos objetos microscópicos situó más cercano a uno a que la mitad de la longitud de onda de la luz era común probablemente imposible.

Éste es el “límite del Abbe” o “límite de difracción” para la microscopia debido qué científicos no podrían visualizar sin obstrucción las estructuras más pequeñas a de 200 nanómetro (mitad de la longitud de onda de la luz azul lejana, que tiene una longitud de onda de 400nm).

En 2014, concedieron Guillermo Moerner, infierno de Stefan, y Eric Betzig el Premio Nobel En la química para desarrollar los tipos radicales de microscopies fluorescencia-basados que podrían ofrecer la resolución mucho más alla de ésas impuestas por el límite del Abbe.

Mientras que el infierno de Stefan desarrolló microscopia de fluorescencia de STED (agotamiento de la emisión estimulada), el trabajo de Moerner y de Betzig puso independientemente los asientos de la única microscopia de la molécula.

Principios de SMLM

la microscopia de la Estupendo-resolución se basa en el conocimiento que la posición de un único fluoróforo se puede localizar mucho más exacto que el alcance de ~200 nanómetro dictado por el límite de difracción.

La potencia de resolución de cualquier microscopio es determinada por la longitud de onda de la luz usada y la apertura numérica o la luz cerco la capacidad de la lente de objetivo. Debido a estos dos factores, cualquier fuente de punto de la luz que es más pequeña que el límite de difracción aparecerá ser borrosa y más grande que está realmente.

El PSF (función de extensión del punto) de un instrumento es una característica que describe este “efecto de la niebla”, o cómo un objeto más pequeño que el límite de difracción aparece bajo cierta proyección de imagen condiciona. PSF es caracterizado midiendo la anchura evidente de un objeto fluorescente en un punto donde está el 50% su intensidad del máximo, llamada el FWHM (de ancho total en el medio máximo).

Usando FWHM, la posición de una única molécula fluorescente se puede obtener con una precisión de hasta sólo 1 nanómetro. Esta precisión es limitada principal por el número de fotones cerco en cada punto y es equivalente al FWHM dividido por la raíz cuadrada del número de fotones cerco.

Aunque la visualización únicos de fluorophores escasos sea un método excelente para emplear cuando estudie la dinámica de las moléculas específicas del objetivo, no es muy útil en estudiar los sistemas biológicos complejos que son apretados altamente y densos. La llave a obtener la estupendo-resolución en tales sistemas es la separación temporal de moléculas activamente que son fluorescentes, que forma la base de SMLM.

Todas las técnicas de SMLM se conectan a tierra en el principio temporal de modular la emisión de un pequeño equipo de fluorophores. Una inferior-intensidad de rayo láser se utiliza para activar estocástico, localiza, y reversible o irreversible blanquea algunos fluorophores en cualquier punto del tiempo dado; relanzando este proceso muchos millares de épocas ofrecen imágenes detalle-ricas altamente resueltas.

Tipos de SMLM

Las técnicas de SMLM difieren principal en los tipos de fluorophores usados, y los métodos usados para controlar temporal las configuraciones de la emisión de estos fluorophores.

PALMA (microscopia de la localización de PhotoActivated), FPALM (microscopia de la localización de PhotoActivated de la fluorescencia), y TORMENTA (microscopia óptica estocástica de la reconstrucción)

Las tres técnicas utilizan la misma metodología de fluorophores que activan con un de rayo láser de alta intensidad, siguiendo que un laser de la inferior-intensidad se utilice estocástico para excitar fluorescencia en un equipo escaso de fluorophores. Sin embargo, varias diferencias entre estas técnicas existen.

La PALMA y FPALM utilizaron originalmente las proteínas tales como PA-GFP (proteína fluorescente verde de PhotoActivatable) como fluorophores, mientras que la TORMENTA utilizó los tintes sintetizados Cy3 y Cy5 del carbocyanine.

Además, en PALMA y FPALM, el fluoróforo es expresado generalmente por la célula como proteína de la fusión marcada con etiqueta a la proteína del interés, mientras que, los elementos celulares endógenos immunolabelled usando los anticuerpos marcados con etiqueta con los fluorophores en TORMENTA. Sin embargo, es posible utilizar los tintes sintetizados en experimentos de la PALMA y las proteínas fluorescentes para los experimentos de la TORMENTA.

Además de estas diferencias, la vida de un fluoróforo es generalmente limitado debido a la fotoactivación y a los procesos photobleaching en PALMA y FPALM.

En TORMENTA, sin embargo, el fenómeno de photoblinking (donde los interruptores fluoróforos aleatoriamente entre LEJOS o el estado oscuro a CONECTADO o emitiendo el estado bajo excitación contínua) se utiliza para la separación temporal de activación de la fluorescencia.

FPALM difiere de la PALMA y la TORMENTA en la técnica de proyección de imagen usada-FPALM utiliza microscopia de fluorescencia confocal tradicional, mientras que la PALMA y la TORMENTA utilizan TIRFM (microscopia de fluorescencia total de la reflexión interna).

En TIRFM, los fluorophores limitados a la superficie de células/de tejidos en contacto con una tira de cristal o la pared del contenedor se excitan selectivamente; esto reduce el número de fluorophores emocionados en la muestra, haciendo el ideal de la técnica para la única detección de la molécula.  

FRÍO (localización óptica criogénica en 3 dimensiones)

El FRÍO, desarrollado en 2016 lleva microscopia de fluorescencia su límite fundamental según lo dictado por la talla del fluoróforo. El FRÍO permite la localización sub-molecular de sitios fluorescentes múltiples dentro de una única molécula de proteína, ofreciendo la resolución en el nivel del angstrom.

La técnica utiliza bajas temperaturas para retrasar reacciones fotoquímicas en fluorophores; esto permite la emisión de números más elevados de fotones antes de photobleaching, por lo tanto aumentando la precisión de la localización. Las imágenes de 2 dimensiones de fluorophores se pueden utilizar para reconstruir configuraciones de 3 dimensiones usando los algoritmos prestados de microscopia electrónica.

Fuentes:

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Last Updated: May 29, 2018

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