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ARN d'Unique-Noyau ordonnançant le protocole (sNuc-seq)

l'ordonnancement d'ARN d'Unique-noyau, également connu sous le nom de sNuc-seq, est une méthode développée récemment de profiler l'expression du gène en cellules il est difficile d'isoler que, ou tissu qui a été archivé utilisant les noyaux d'isolement. La méthode est relativement coût bas mais produit des caractéristiques élevées de débit, permettant à des usagers de profiler plusieurs milliers de noyaux.

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Techniques d'isolement de noyaux

Un bénéfice important de sNuc-seq est qu'il n'utilise pas des méthodes stressantes de dissassociation de cellules. Généralement, sNuc-seq concerne habituellement la perturbation de tissu et le lysis de cellules, effectués dans des conditions froides, suivi de centrifugation et de séparer les noyaux des saletés. Cependant, il y a plusieurs méthodes qui peuvent être employées pour relâcher les noyaux des cellules avant de l'isolement et d'ordonnancer.

La moelle épinière contient des neurones particulièrement vulnérables à la mort cellulaire, et qui exigent pour cette raison des méthodes plus fragiles de relâcher les noyaux de la cellule. le lysis Détergent-mécanique de cellules concerne employer un pilon, un homogénisateur, et un tampon détergent de lysis pour lyser des cellules. Cette méthode a l'avantage d'activer la pleine perturbation de tissu et produit ainsi d'une plus grande puissance finale de noyaux.

Une autre méthode, lysis hypotonique-mécanique appelé de cellules, concerne à l'aide du tampon et des pipettes hypotoniques de lysis pour lyser graduellement des cellules. Tandis que les deux méthodes fournissent avec succès les niveaux comparables de l'ARN et les numéros des gènes selon le noyau, le lysis hypotonique-mécanique a l'avantage ajouté d'un niveau contrôlable de perturbation de tissu. Ceci fournit l'étendue pour choisir un reste entre la quantité et la pureté de la puissance nucléaire finale.

protocoles sNuc-seq

Une fois que les noyaux ont été isolés utilisant une des techniques procurables, les noyaux sont homogénéisés et comptés. Après ceci, les échantillons peuvent s'analyser utilisant les plates-formes de sNuc-ordonnancement. Généralement il y a deux plates-formes principales pour sNuc-seq massivement parallèle : la plate-forme scolaire et la plate-forme commerciale.

Une méthode utilisée généralement de sNuc-seq de la plate-forme scolaire est la procédure Goutte-seq. Dans elle, des gouttelettes sont produites à l'aide d'un dispositif microfluidic. Les gouttelettes contiennent une cellule avec un talon seulement identifiable.

Le rétablissement de gouttelette est suivi du bris de la gouttelette pour réduire des événements, lavage et resuspendre, et pour finir demande de règlement d'hybridation avec de l'exonucléase d'éliminer les amorces inétendues. Les talons sont séparés et l'ARN branché est amplifié par ACP. L'ADN élogieux est mesuré et amplifié seulement au 3' extrémité, suivie de l'ordonnancement de prochain rétablissement.

Goutte-seq peut être employé pour l'ARN unicellulaire l'ordonnancement et exige de l'entrée d'être spécialisée pour sNuc-seq, tel que la méthode DroNc-seq populaire développée en 2017. Dans cette méthode, des gouttelettes sont employées pour encapsuler les noyaux uniques au lieu des cellules.

La méthode DroNc-seq spécifie des concentrations appropriées pour que la charge de talon et de cellules évite d'avoir plus d'un noyau selon la gouttelette. Des modifications à la méthode DroNc-seq peuvent être apportées en cas d'exécuter sNuc-seq sur des échantillons plus difficiles, tels que des neurones de moelle épinière.

Des plates-formes commerciales sont fournies avec des directives à partir du constructeur. Comme les plates-formes scolaires, certaines méthodes unicellulaires peuvent être employées avec des modifications pour produire des caractéristiques sNuc-seq. Par exemple, les méthodes commerciales utilisant l'ACP pour amplifier l'ADNc peuvent exiger des cycles complémentaires d'ACP de compenser la puissance inférieure d'ADNc des noyaux par rapport aux cellules.

Applications de sNuc-seq

L'avantage clé de toutseq qu'une méthode est qu'elle peut être appliquée aux cellules précédemment limitées il était difficile isoler qu'ou du tissu qui ont été archivés. la boîte sNuc-seq, en analysant ces types de cellules, soit utilisée pour découvrir plus au sujet de la maladie, de l'immunité, de la neurobiologie, et de la biologie de centrale.

En neurobiologie, sNuc-seq a été avec succès employé pour distinguer les types de cellules et la composition neuronale et non-neuronale de sous-type. En outre, il a été employé pour trouver et mesurer l'activité neuronale en cerveaux mammifères à la définition temporelle élevée.

Les résultats de telles études indiquent que des différences dans le transcriptome entre les sous-types relatifs sont provoquées par les programmes transcriptionnels qui dépendent de l'activité neuronale, plutôt que par des différences dans l'origine de développement ou la distribution anatomique. Cependant, parce que sNuc-seq dissocie des noyaux en tissus, des informations sur la localisation anatomique originelle des cellules sont détruites.

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Last Updated: Apr 5, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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