l'ordinamento del RNA del Unico nucleo, anche conosciuto come sNuc-seguente, è un metodo sviluppato di recente di delineamento dell'espressione genica nelle celle che sono dure da isolare, o in tessuto che è stato archivato facendo uso dei nuclei isolati. Il metodo è basso costo relativamente ma che genera gli alti dati di capacità di lavorazione, permettendo che gli utenti profilino parecchie migliaia di nuclei.
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Tecniche di isolamento dei nuclei
Un vantaggio significativo di sNuc-seguente è che non utilizza i metodi stressanti di disassociation delle cellule. Generalmente, sNuc-seguente comprende solitamente la rottura del tessuto e la lisi delle cellule, effettuate nelle circostanze fredde, seguito centrifugazione e separando i nuclei dai detriti. Tuttavia, ci sono parecchi metodi che possono essere usati per rilasciare i nuclei dalle celle prima di isolamento e dell'ordinamento.
Il midollo spinale contiene i neuroni particolarmente vulnerabili alla morte delle cellule e che quindi richiedono i metodi più delicati di rilascio dei nuclei dalla cella. la lisi Detersivo-meccanica delle cellule comprende per mezzo di un pestello, di un omogeneizzatore e di un buffer detergente di lisi per fare l'elettrolisi le celle. Questo metodo presenta il vantaggio di permettere alla rottura completa del tessuto e così genera un più grande rendimento definitivo dei nuclei.
Un altro metodo, chiamato lisi ipotonico-meccanica delle cellule, comprende per mezzo del buffer e delle pipette ipotonici di lisi per fare l'elettrolisi gradualmente le celle. Mentre entrambi i metodi rendono con successo i livelli comparabili di RNA ed i numeri dei geni per nucleo, la lisi ipotonico-meccanica ha il vantaggio aggiunto di un livello controllabile di rottura del tessuto. Ciò fornisce la portata per scegliere un bilanciamento fra la quantità e la purezza del rendimento nucleare definitivo.
protocolli sNuc-seguenti
Una volta che i nuclei sono stati isolati facendo uso di una delle tecniche disponibili, i nuclei sono omogeneizzati e contati. A seguito di questo, i campioni possono essere analizzati facendo uso delle piattaforme d'ordinamento. Ci sono generalmente due piattaforme principali per sNuc-seguente in maniera massiccia parallelo: la piattaforma accademica e la piattaforma commerciale.
Un metodo comunemente usato di sNuc-seguente dalla piattaforma accademica è la procedura Goccia-seguente. In, le goccioline sono generate usando un'unità microfluidic. Le goccioline contengono un unicellulare con una perla unicamente identificabile.
La generazione della gocciolina è seguita da rottura della gocciolina per diminuire gli eventi, lavaggio e risospendere ed il trattamento di ibridazione con il exonuclease eliminare infine le mani di fondo unextended. Le perle sono separate ed il RNA connesso è ampliato dalla PCR. Il DNA gratuito è quantificato ed ampliato al soltanto 3' estremità, seguita dall'ordinamento della generazione seguente.
Goccia-seguente può essere usato per RNA unicellulare ordinare e richiede l'input di essere specializzato per sNuc-seguente, quale il metodo DroNc-seguente popolare messo a punto nel 2017. In questo metodo, le goccioline sono usate per incapsulare i singoli nuclei invece delle celle.
Il metodo DroNc-seguente specifica le concentrazioni appropriate affinchè il caricamento delle cellule e della perla eviti di avere più di un nucleo per gocciolina. Le modifiche al metodo DroNc-seguente possono essere apportate in caso di esecuzione sNuc-seguente sui campioni più difficili, quali i neuroni del midollo spinale.
Le piattaforme commerciali sono fornite con le istruzioni dal produttore. Come le piattaforme accademiche, determinati metodi unicellulari possono essere usati con le modifiche per generare i dati sNuc-seguenti. Per esempio, i metodi commerciali che utilizzano la PCR per ampliare il cDNA possono richiedere i cicli supplementari di PCR di compensare il rendimento più basso del cDNA dai nuclei rispetto alle celle.
Applicazioni di sNuc-seguente
Il vantaggio chiave per quanto un metodo sia di sNuc-seguente che può applicarsi alle celle precedentemente limitate che erano difficili da isolare o del tessuto che sono stati archivati. la latta sNuc-seguente, analizzando questi tipi delle cellule, è utilizzata per scoprire più circa la malattia, l'immunità, la neurobiologia e la biologia dell'impianto.
In neurobiologia, sNuc-seguente è stato usato con successo per distinguere fra i tipi delle cellule e la composizione di un neurone e non di un neurone in sottotipo. Ancora, è stato usato per individuare e quantificare l'attività di un neurone in cervelli mammiferi ad alta risoluzione temporale.
I risultati da tali studi indicano che le differenze nel transcriptome fra i sottotipi relativi sono causate dai programmi trascrizionali che dipendono dall'attività di un neurone, piuttosto che tramite le differenze nell'origine inerente allo sviluppo o nella distribuzione anatomica. Tuttavia, perché sNuc-seguente dissocia i nuclei in tessuti, le informazioni sulla posizione anatomica originale delle cellule sono perse.
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