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RNA del Unico Nucleo che ordina protocollo (sNuc-seguente)

l'ordinamento del RNA del Unico nucleo, anche conosciuto come sNuc-seguente, è un metodo sviluppato di recente di delineamento dell'espressione genica nelle celle che sono dure da isolare, o in tessuto che è stato archivato facendo uso dei nuclei isolati. Il metodo è basso costo relativamente ma che genera gli alti dati di capacità di lavorazione, permettendo che gli utenti profilino parecchie migliaia di nuclei.

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Tecniche di isolamento dei nuclei

Un vantaggio significativo di sNuc-seguente è che non utilizza i metodi stressanti di disassociation delle cellule. Generalmente, sNuc-seguente comprende solitamente la rottura del tessuto e la lisi delle cellule, effettuate nelle circostanze fredde, seguito centrifugazione e separando i nuclei dai detriti. Tuttavia, ci sono parecchi metodi che possono essere usati per rilasciare i nuclei dalle celle prima di isolamento e dell'ordinamento.

Il midollo spinale contiene i neuroni particolarmente vulnerabili alla morte delle cellule e che quindi richiedono i metodi più delicati di rilascio dei nuclei dalla cella. la lisi Detersivo-meccanica delle cellule comprende per mezzo di un pestello, di un omogeneizzatore e di un buffer detergente di lisi per fare l'elettrolisi le celle. Questo metodo presenta il vantaggio di permettere alla rottura completa del tessuto e così genera un più grande rendimento definitivo dei nuclei.

Un altro metodo, chiamato lisi ipotonico-meccanica delle cellule, comprende per mezzo del buffer e delle pipette ipotonici di lisi per fare l'elettrolisi gradualmente le celle. Mentre entrambi i metodi rendono con successo i livelli comparabili di RNA ed i numeri dei geni per nucleo, la lisi ipotonico-meccanica ha il vantaggio aggiunto di un livello controllabile di rottura del tessuto. Ciò fornisce la portata per scegliere un bilanciamento fra la quantità e la purezza del rendimento nucleare definitivo.

protocolli sNuc-seguenti

Una volta che i nuclei sono stati isolati facendo uso di una delle tecniche disponibili, i nuclei sono omogeneizzati e contati. A seguito di questo, i campioni possono essere analizzati facendo uso delle piattaforme d'ordinamento. Ci sono generalmente due piattaforme principali per sNuc-seguente in maniera massiccia parallelo: la piattaforma accademica e la piattaforma commerciale.

Un metodo comunemente usato di sNuc-seguente dalla piattaforma accademica è la procedura Goccia-seguente. In, le goccioline sono generate usando un'unità microfluidic. Le goccioline contengono un unicellulare con una perla unicamente identificabile.

La generazione della gocciolina è seguita da rottura della gocciolina per diminuire gli eventi, lavaggio e risospendere ed il trattamento di ibridazione con il exonuclease eliminare infine le mani di fondo unextended. Le perle sono separate ed il RNA connesso è ampliato dalla PCR. Il DNA gratuito è quantificato ed ampliato al soltanto 3' estremità, seguita dall'ordinamento della generazione seguente.

Goccia-seguente può essere usato per RNA unicellulare ordinare e richiede l'input di essere specializzato per sNuc-seguente, quale il metodo DroNc-seguente popolare messo a punto nel 2017. In questo metodo, le goccioline sono usate per incapsulare i singoli nuclei invece delle celle.

Il metodo DroNc-seguente specifica le concentrazioni appropriate affinchè il caricamento delle cellule e della perla eviti di avere più di un nucleo per gocciolina. Le modifiche al metodo DroNc-seguente possono essere apportate in caso di esecuzione sNuc-seguente sui campioni più difficili, quali i neuroni del midollo spinale.

Le piattaforme commerciali sono fornite con le istruzioni dal produttore. Come le piattaforme accademiche, determinati metodi unicellulari possono essere usati con le modifiche per generare i dati sNuc-seguenti. Per esempio, i metodi commerciali che utilizzano la PCR per ampliare il cDNA possono richiedere i cicli supplementari di PCR di compensare il rendimento più basso del cDNA dai nuclei rispetto alle celle.

Applicazioni di sNuc-seguente

Il vantaggio chiave per quanto un metodo sia di sNuc-seguente che può applicarsi alle celle precedentemente limitate che erano difficili da isolare o del tessuto che sono stati archivati. la latta sNuc-seguente, analizzando questi tipi delle cellule, è utilizzata per scoprire più circa la malattia, l'immunità, la neurobiologia e la biologia dell'impianto.

In neurobiologia, sNuc-seguente è stato usato con successo per distinguere fra i tipi delle cellule e la composizione di un neurone e non di un neurone in sottotipo. Ancora, è stato usato per individuare e quantificare l'attività di un neurone in cervelli mammiferi ad alta risoluzione temporale.

I risultati da tali studi indicano che le differenze nel transcriptome fra i sottotipi relativi sono causate dai programmi trascrizionali che dipendono dall'attività di un neurone, piuttosto che tramite le differenze nell'origine inerente allo sviluppo o nella distribuzione anatomica. Tuttavia, perché sNuc-seguente dissocia i nuclei in tessuti, le informazioni sulla posizione anatomica originale delle cellule sono perse.

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Last Updated: Apr 5, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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