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Microscopie plate unique d'illumination (SPIM) en biologie cellulaire

Le comportement de visualisation de cellules a été l'objectif de beaucoup de techniques développées à la 20ème et au 21ème siècle. Des cellules ont été au commencement conçues après avoir retiré de l'organisme après la mort.

Cependant, visualisation en temps réel des cellules par fluorescent marquant encore en raison difficile prouvé du degré de transparence requis pour voir la fluorescence. De même, les techniques d'imagerie ont eu des problèmes avec la dispersion de la lumière. La microscopie plate sélectrice d'illumination (SPIM) ou la microscopie de nappe de lumière diffère représentation de haute résolution d'offres aux profondeurs variées de cellules en tissus sous tension.

Technique de SPIM

Principe

Les techniques de SPIM peuvent différer légèrement, mais suivent le même principe général : l'excitation légère provient à angle droit à la lentille optique. Pour cette raison, le circuit d'illumination et le circuit trouvant (la lentille) sont indépendant de l'un l'autre et peuvent être manipulés séparé. Ceci diffère des approches conventionnelles de microscopie, qui ont type la même illumination et trouver la source de voie. L'objectif d'intérêt est mis au plan focal de la lentille trouvante où le circuit d'illumination et de dépistage se réunissent. L'échantillon est excité par la source d'illumination et puis trouvé par le bloc optique de dépistage et imagé utilisant un appareil-photo. Pour une image 3D, l'échantillon est déménagé légèrement plusieurs fois d'acquérir plusieurs images pour concevoir la profondeur.

Briser la limite de diffraction

La source d'illumination forme un aspect important de quel type d'image vous obtenez et comment détaillé. L'illumination parfaite serait une source lumineuse continuelle et mince en travers du circuit entier d'illumination. Cependant, la feuille légère est limitée par diffraction. Au lieu de cela, on emploie une source lumineuse cylindrique qui varie dans l'épaisseur en travers du circuit de l'illumination en convergeant vers le centre. L'épaisseur de la feuille légère est réglée pour maintenir l'uniforme léger en travers du champ de vision, s'échelonnant de 1 µm pour de petits échantillons (µm <100) sur le µm 10 pour de plus grands échantillons (5 millimètres).

Échantillons épais de représentation

La source d'illumination détermine également la profondeur de l'échantillon, qui est habituellement le µm environ 10 ou moins. Quand SPIM a été employé sur un poisson, il a atteint une profondeur de représentation du µm jusqu'à 500. Il a des applications dans l'étude des organismes entiers, car l'appareillage de représentation de SPIM peut être accumulé autour de la chambre d'un organisme de sorte que l'animal soit maintenu vivant et dans des conditions optimales.

Microscopy: Super-Resolution: Structured Illumination Microscopy (SIM) (David Agard)

Applications

Définition axiale accrue en biologie du développement

En biologie du développement, l'appareillage de dépistage doit avoir la longue lentille de distance de fonctionnement (distance de lentille à la fiche de transmission de panneau) et l'ouverture numérique inférieure (capacité de système optique de recueillir ou émettre la lumière). De telles lentilles ont la définition axiale faible, mais dans SPIM la valeur qui est illuminée est définie par la nappe de lumière qui augmente la définition axiale. Quand SPIM a été initialement développé, écrit le fonctionnement d'écart axial cité de remarque (PSF) du µm 6 comparé au µm 20 ci-dessus quand la feuille légère a été retirée.

Structures uniques et multicellulaires de représentation

SPIM a des applications en cellules et structures multicellulaires. Les cellules mettent en boîte dans d'autres techniques de microscopie soient exposées au blanchiment, où des molécules fluorescentes sont détruites par la lumière. Dans SPIM, le blanchiment est inférieur, qui est particulièrement avantageux pour l'étude unicellulaire. Le blanchiment inférieur permet l'acquisition continue des images des structures dynamiques. Avec l'arrivée d'élever les cultures 3D, SPIM est s'avérer également utile pour comprendre leur développement à l'intérieur de la chambre 3D.

Structure et dynamique des microtubules

Intracellulairement, la biophysique et la dynamique des microtubules mieux ont été comprises utilisant SPIM. Le blanchiment inférieur a tenu compte de l'acquisition continue pendant 15 mn dans 3D. Les études précédentes faites sur les 2D surfaces ont indiqué les agencements structurels des parties variées des microtubules, mais il était peu clair comment les centrioles déménagent l'espace 3D. Les caractéristiques rassemblées utilisant SPIM peuvent être employées pour raffiner des modèles de la façon dont les microtubules se comportent dans un réaliste, l'espace 3D.

Représentation in vivo on le sait que beaucoup de procédés biologiques, tels que l'accroissement et l'apoptose, sont réglés ou déclenchés par des interactions complexes autour de elles. Ainsi, la recherche croissante est concentrée sur la façon vérifier ces phénomènes dans des réglages plus naturels, tels que les cultures 3D et les organoids. SPIM vérifie des cellules quand les lignes entre in vivo et in vitro est tremblé. Des techniques pour ceci actuel sont développées, avec l'espoir que ceci accélérera davantage notre compréhension des inducteurs tirant bénéfice déjà des cultures cellulaires 3D, telles que l'immunologie et la cancérologie.

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Last Updated: Aug 23, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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