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Singola microscopia piana di illuminazione (SPIM) in biologia cellulare

Il comportamento di visualizzazione delle cellule è stato lo scopo di molte tecniche sviluppate nelle ventesime e nel XXI secolo. Le celle inizialmente sono state visualizzate dopo l'eliminazione dall'organismo dopo la morte.

Tuttavia, la visualizzazione in tempo reale delle celle con il contrassegno fluorescente ancora ha provato difficile dovuto il grado di trasparenza richiesto per vedere la fluorescenza. Similmente, le tecniche di rappresentazione hanno avute problemi con lo scattering leggero. La microscopia piana selettiva dell'illuminazione (SPIM) o la microscopia della luminoso lamiera sottile differisce la rappresentazione di alta risoluzione di offerte alle varie profondità delle cellule in tessuti in tensione.

Tecnica di SPIM

Principio

Le tecniche di SPIM possono differire leggermente, ma seguono lo stesso principio generale: l'eccitazione leggera nasce all'angolo retto alla lente ottica. A causa di questo, il percorso dell'illuminazione ed il percorso di rilevazione (la lente) sono indipendenti da a vicenda e possono essere manipolati esclusivamente. Ciò differisce dagli approcci convenzionali di microscopia, che hanno tipicamente la stessa illuminazione e rilevazione della sorgente di via. L'oggetto di interesse è collocato al piano focale della lente di rilevazione in cui il percorso di rilevazione e dell'illuminazione si incontra. Il campione è eccitato dalla sorgente dell'illuminazione e poi è individuato dall'ottica di rilevazione ed imaged facendo uso di una macchina fotografica. Per un'immagine 3D, il campione è mosso leggermente parecchie volte acquistare parecchie immagini per prevedere la profondità.

Rottura del limite di diffrazione

La sorgente dell'illuminazione forma un aspetto importante di che tipo immagine ottenete e come dettagliato. L'illuminazione perfetta sarebbe una sorgente luminosa costante e sottile attraverso l'intero percorso dell'illuminazione. Tuttavia, la lamiera sottile leggera è limitata dalla diffrazione. Invece, una sorgente luminosa cilindrica è usata che varia di spessore attraverso il percorso dell'illuminazione convergendo verso il centro. Lo spessore della lamiera sottile leggera è regolato per tenere l'uniforme leggera attraverso il campo visivo, variante da 1 µm per i piccoli campioni (µm <100) al µm 10 per i più grandi campioni (5 millimetri).

Campioni spessi di rappresentazione

La sorgente dell'illuminazione egualmente determina la profondità del campione, che è solitamente µm intorno 10 o di meno. Quando SPIM è stato usato su un pesce, ha raggiunto una profondità della rappresentazione di µm fino a 500. Ha applicazioni nello studio sugli interi organismi, poichè l'apparecchiatura della rappresentazione di SPIM può essere sviluppata intorno alla camera di un organismo in moda da tenere l'animale vivo e nelle circostanze ottimali.

Microscopy: Super-Resolution: Structured Illumination Microscopy (SIM) (David Agard)

Applicazioni

Risoluzione assiale aumentata in biologia dello sviluppo

In biologia dello sviluppo, l'apparecchiatura di rilevazione deve avere la lente lunga di distanza di funzionamento (distanza fra la lente e il franamento del coperchio) e apertura diaframma numerica bassa (capacità del sistema ottico di riunire o emettere indicatore luminoso). Tali lenti hanno risoluzione assiale difficile, ma in SPIM l'importo che è illuminato è definito dalla luminoso lamiera sottile che aumenta la risoluzione assiale. Quando SPIM originalmente è stato sviluppato, crea una funzione di dispersione assiale citata del punto (PSF) di µm 6 confrontato al µm superiore 20 quando la lamiera sottile leggera è stata eliminata.

Singole e strutture multicellulari di rappresentazione

SPIM ha applicazioni in sia unicellulari che strutture multicellulari. Le celle inscatolano in altre tecniche di microscopia sono esposte ad imbianchimento, dove le molecole fluorescenti si distruggono da indicatore luminoso. In SPIM, l'imbianchimento è basso, che è particolarmente utile per lo studio unicellulare. L'imbianchimento basso permette l'acquisizione continua delle immagini delle strutture dinamiche. Con l'arrivo di coltura delle culture 3D, SPIM è anche risultare utile capire il loro sviluppo dentro la camera 3D.

Struttura e dinamica dei microtubuli

Intracellulare, la biofisica e la dinamica dei microtubuli sono state capite meglio facendo uso di SPIM. L'imbianchimento basso ha tenuto conto acquisizione continua per 15 minuti in 3D. Gli studi precedenti fatti sulle 2D superfici hanno rivelato le disposizioni strutturali di varie sezioni dei microtubuli, ma era poco chiaro come i centrioli si muovono nello spazio 3D. I dati raccolti facendo uso di SPIM possono essere usati per raffinare i modelli di come i microtubuli si comportano in un realistico, spazio 3D.

La rappresentazione in vivo è conosciuto che molti trattamenti biologici, quali la crescita ed il apoptosis, sono regolamentati o avviati dalle interazioni complesse intorno loro. Quindi, la ricerca aumentante è messa a fuoco su come studiare questi fenomeni nelle impostazioni più naturali, quali le culture 3D e i organoids. SPIM studia le celle quando le righe in mezzo in vivo e in vitro è offuscato. Le tecniche per questa corrente stanno sviluppande, con la speranza che questa più ulteriormente accelererà la nostra comprensione dei campi già che traggono giovamento dalle colture cellulari 3D, quali l'immunologia e la ricerca sul cancro.

Sorgenti

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Last Updated: Aug 23, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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