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Única microscopia plana da iluminação (SPIM) na biologia celular

O comportamento visualizando da pilha foi o objetivo de muitas técnicas desenvolvidas no 20as e no século XXI. As pilhas foram visualizadas inicialmente após a remoção do organismo após a morte.

Contudo, o visualisation do tempo real das pilhas com da rotulagem fluorescente ainda provou difícil devido ao grau de transparência exigido para considerar a fluorescência. Similarmente, as técnicas de imagem lactente tiveram problemas com dispersão de luz. A microscopia plana selectiva da iluminação (SPIM) ou a microscopia da luz-folha diferem imagem lactente de alta resolução das ofertas em várias profundidades da pilha em tecidos vivos.

Técnica de SPIM

Princípio

As técnicas de SPIM podem diferir ligeira, mas seguem o mesmo princípio geral: a excitação clara origina no ângulo direito à lente óptica. Devido a isto, o trajecto da iluminação e o trajecto de detecção (a lente) são independente de se e podem ser manipulados separada. Isto difere das aproximações convencionais da microscopia, que têm tipicamente a mesma iluminação e a detecção da fonte do caminho. O objeto do interesse é colocado no plano focal da lente de detecção onde o trajecto da iluminação e da detecção se encontra. A amostra é entusiasmado pela fonte da iluminação e é detectada então pelo sistema ótico da detecção e imaged usando uma câmera. Para uma imagem 3D, a amostra é movida ligeira diversas vezes adquirir diversas imagens para visualizar a profundidade.

Quebrando o limite de difracção

A fonte da iluminação forma um aspecto importante de que tipo de imagem você obtem e como detalhado. A iluminação perfeita seria uma fonte luminosa constante e fina através do trajecto inteiro da iluminação. Contudo, a folha clara é limitada pela difracção. Em lugar de, uma fonte luminosa cilíndrica é usada que varie na espessura através do trajecto da iluminação convirgindo para o centro. A espessura da folha clara é ajustada para manter o uniforme leve através do campo de visão, variando de 1 µm para amostras pequenas (µm <100) ao µm 10 para as amostras maiores (5 milímetros).

Amostras grossas da imagem lactente

A fonte da iluminação igualmente determina a profundidade da amostra, que é geralmente o µm ao redor 10 ou o menos. Quando SPIM foi usado em um peixe, alcançou uma profundidade da imagem lactente do µm até 500. Tem aplicações no estudo de organismos inteiros, porque o instrumento da imagem lactente de SPIM pode ser acumulado em torno da câmara de um organismo de modo que o animal seja mantido vivo e em circunstâncias óptimas.

Microscopy: Super-Resolution: Structured Illumination Microscopy (SIM) (David Agard)

Aplicações

Definição axial aumentada na biologia desenvolvente

Na biologia desenvolvente, o instrumento da detecção precisa de ter a lente longa da distância de funcionamento (distância da lente ao enxerto da tampa) e a baixa abertura numérica (capacidade do sistema óptico para recolher ou se emitir a luz). Tais lentes têm a definição axial deficiente, mas em SPIM a quantidade que é iluminada é definida pela luz-folha que aumenta a definição axial. Quando SPIM foi desenvolvido originalmente, é o autor de uma função de propagação axial mencionada do ponto (PSF) do µm 6 comparado ao µm 20 acima quando a folha clara foi removida.

Únicas e estruturas multicellular da imagem lactente

SPIM manda aplicações em escolher pilhas e estruturas multicellular. As pilhas enlatam em outras técnicas da microscopia sejam expor ao descoramento, onde as moléculas fluorescentes sãas pela luz. Em SPIM, o descoramento sido baixo, que é particularmente benéfico para o único estudo da pilha. O baixo descoramento permite a aquisição contínua das imagens de estruturas dinâmicas. Com o advento de crescer as culturas 3D, SPIM é igualmente provar útil compreender sua revelação dentro da câmara 3D.

Estrutura e dinâmica dos microtubules

Intracellularly, a biofísica e a dinâmica dos microtubules foram compreendidas melhor usando SPIM. O baixo descoramento permitiu a aquisição contínua por 15 minutos em 3D. Os estudos precedentes feitos em 2D superfícies revelaram o regime estrutural de várias secções dos microtubules, mas era obscuro como as centrioles se movem no espaço 3D. Os dados recolhidos usando SPIM podem ser usados para refinar modelos de como os microtubules se comportam em um realístico, o espaço 3D.

Imagem lactente in vivo sabe-se que muitos processos biológicos, tais como o crescimento e o apoptosis, estão regulados ou provocados por interacções complexas em torno delas. Assim, a pesquisa crescente é focalizada em como investigar estes fenômenos em uns ajustes mais naturais, tais como as culturas 3D e os organoids. SPIM investigar pilhas quando as linhas é borrado no meio in vivo e in vitro. As técnicas para esta estão sendo desenvolvidas actualmente, com a esperança que esta acelerará mais nossa compreensão dos campos já que tiram proveito das culturas celulares 3D, tais como a imunologia e a investigação do cancro.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Aug 23, 2018

Sara Ryding

Written by

Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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