principi & usi di Cryo-EM della Unico particella

la microscopia elettronica criogenica della Unico particella (cryo-EM) è una tecnica analitica usata per dedurre la struttura 3D delle macromolecole (specialmente proteine) come alternativa a cristallografia a raggi x. Non è comunemente usata nella pratica quotidiana ma offre alcuni vantaggi sopra altre tecniche.

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Virus di Zika. Struttura livellata atomica, risoluta dal cryo-EMmolekuul_be | Shutterstock

Come il cryo-EM della unico particella funziona?

La proteina pura si applica ad una griglia con i fori molto piccoli, di supporto normalmente da una struttura del metallo. Ciò distribuirà idealmente uniformemente le molecole di proteina in tutto questi fori nella griglia, negli orientamenti varianti.

Questa griglia è poi improvviso congelata immergendo in una soluzione come azoto liquido o ghiaccio secco. Ciò inizialmente crea un'istantanea stabile della proteina in vari orientamenti ed egualmente previene danni certo to la proteina come pure evita l'evaporazione del buffer.

Le immagini sono catturate di tutte le diverse proteine in questa griglia e poi sono state allineate e fatte la media per creare una mappa 3D. I lotti di trattamento e dell'analisi entra in tappe finali di questi dati, definitivo producenti un modello 3D della struttura della proteina.

Che cosa fa lo speciale cryo-EM?

Il singolo cryo-EM della particella crea un'istantanea più distinta del comportamento di una proteina a certo punto temporale determinato, confrontato alla cristallografia dove le proteine devono formare insieme una grata ordinata prima che la struttura possa essere risoluta.

dovuto questa differenza, cryo-EM può potenzialmente dare una comprensione più accurata nel modulo naturale di una proteina e fornire più informazioni su come possono funzionare.

Permettere che la proteina sia mobile su fino a catturare un'istantanea può essere una sfida comunque, poichè rende l'analisi di calcolo di una proteina molto più difficile, perché molte immagini della proteina nelle posizioni e negli orientamenti differenti devono essere collazionate insieme.

Facendo uso del cryo-EM della unico particella per analisi della proteina

La determinazione della struttura 3D delle proteine rappresenta la applicazione principale di questa tecnica. Gli altri due metodi main di deduzione della struttura della proteina è cristallografia a raggi x o a risonanza magnetica nucleare (NMR).

Il trattamento della cristallografia può essere molto inaffidabile e lungo. Gli stati esatti dell'ambiente della proteina devono essere trovati in modo che la proteina per formare una grata regolare. Molti schermi, quindi, sono necessari per produrre i migliori cristalli di qualità per redigere i dati di diffrazione ai raggi X.

Relativamente un gran numero di campioni sono necessari per la cristallografia e RMN confrontati al singolo cryo-EM della particella. Ciò è un grande vantaggio del cryo-EM, significante che può potenzialmente essere più facile e più economica rispetto ad altre metodologie.

Il singolo cryo-EM della particella può anche essere usato per tutte le dimensioni di proteina, mentre RMN ha una restrizione di dimensione per le proteine che possono essere analizzate. Ciò dà acryo-EM un più vasto intervallo delle opzioni per analisi strutturale della proteina.

Vantaggi

dovuto la metodologia semplice ed affidabile del cryo-EM della unico particella, è possibile analizzare non solo le proteine semplici, ma anche complessi della proteina e polimeri come F-actina e microtubuli come pure complessi di inizio della trascrizione. Molti complessi della proteina esistono soltanto per i lassi di tempo molto brevi e questa tecnica li permette di essere visualizzati.

Altri complessi che il cryo-EM ha permesso allo studio approfondito di sono complessi nucleari, in cui la proteina lega a DNA o a RNA. Molti aspetti importanti di macchinario cellulare contano su questi complessi, includendo durante la sintesi del RNA e del replicazione del dna.

Ci sono molte strutture in di cui la cristallografia non può determinare la struttura, eppure il singolo cryo-EM della particella può. Un esempio di questi è proteine della membrana. Il dominio del transmembrane di queste proteine deve essere stabilizzato nelle soluzioni dai detersivi, che possono rendere la cristallizzazione delle proteine piuttosto difficile.

Il Cryo-EM può anche determinare la struttura delle proteine con le regioni flessibili senza dovere eliminarli, che è fatta spesso in cristallografia. Ciò ha tagliato un punto potenzialmente molto difficile.

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Last Updated: May 2, 2019

Written by

Jack Davis

Jack is a freelance scientific writer with research experience in molecular biology, genetics, human anatomy and physiology, and advanced analytical chemistry. He is also highly knowledgeable about DNA technology, drug analysis, human disease, and biotechnology.

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