Chromatographie d'exclusion de taille (filtration sur gel)

La chromatographie d'exclusion de taille (SEC) sépare des composantes d'un échantillon sur la base de leur taille moléculaire. L'exclusion ou l'inclusion différentielle des molécules est réalisée par l'intermédiaire de la filtration par un gel qui contient les talons sphériques. Ces talons ont des pores d'une distribution de grandeurs spécifique afin de comprendre ou exclure des molécules de différentes tailles quand ils traversent le gel.

Sec est également connue par d'autres noms tels que la chromatographie d'exclusion, la chromatographie de filtration sur gel, la chromatographie liquide d'exclusion, et la chromatographie de perméation de gel.

Les principes de sec

La séparation des protéines et d'autres composés dans sec est réalisée a basé sur la taille des molécules dans l'échantillon. La technique emploie un gel qui contient les talons sphériques poreux comme matériau d'emballage dans le fléau de chromatographie. Basé sur la distribution de grandeurs des talons, les petites molécules dans l'échantillon diffusent dans les pores dus à ce que leur mouvement est ralenti. En revanche, les molécules plus grandes ne traversent pas les pores, déménager plus rapidement par les talons, et sont éluées. Ainsi, des molécules sont séparées sur la base de leur taille en laissant le fléau par ordre poids moléculaire décroissant.

Des résultats obtenus à partir de cette séparation basée sur taille des molécules permettent à une courbe d'étalonnage d'être construite. Ceci peut être employé pour estimer le poids moléculaire d'une molécule inconnue dans l'échantillon en activant la comparaison avec des protéines ou des polymères de poids moléculaire connu.

Le fractionnement et la déssalement sont les deux types courants de séparations effectuées utilisant sec.

Dans la déssalement des protéines ou des acides nucléiques, la limite d'exclusion du gel est maintenue plus petite que la taille de la molécule d'intérêt. Ainsi la molécule d'intérêt est éluée à l'extérieur tandis que de plus petites molécules sont enfermées dans les pores du gel.

Dans le fractionnement on lui assure que les molécules d'intérêt font partie de la marge du fractionnement du gel. Ainsi, des analytes ayant différents poids moléculaires sont séparées à l'intérieur de la modification de gel.

Les facteurs affectant la définition dans sec

Le choix de gel et les états de marche de sec peuvent varier selon l'application spécifique.

Cotes de fléau

L'augmentation de la longueur de fléau augmente la définition et l'augmentation des résultats de diamètre de fléau en volume de bâti et par conséquent plus haut capacité élevés de fléau. La gamme de fractionnement et la limite d'exclusion peuvent être réglées en variant la taille de pore. Plus la dimension particulaire du gel est petite, plus la définition réalisée est élevée.

Débit

Ceci doit être modéré pour la meilleure définition. C'est parce que les débits modérés donnent assez de temps aux molécules de se servir de l'endroit de surface totale des talons de gel pendant la phase stationnaire, qui permet à de plus petites molécules de prendre du temps d'entrer dans les pores. Ceci a comme conséquence une meilleure séparation des molécules de différentes tailles. La cause lente de débits au-dessus de la diffusion des crêtes et réduisent ainsi la définition.

Emballage de fléau

Overpacking et underpacking peuvent porter préjudice au degré de définition. La définition est également rigoureusement affectée par la présence du volume mort sur le fléau pendant que les molécules dans l'échantillon diffusent avant d'entrer dans le bâti de fléau, qui provoque des larges bandes ou des crêtes plus larges.

Méthode de dépistage

L'UV est le mode le plus très utilisé du dépistage et de la mesure des protéines pendant l'analyse de sec. Les acides aminés aromatiques comme le tryptophane répondent mieux à l'UV proche ou aux plus longues longueurs d'onde. Cependant, des longueurs d'onde plus élevées offrent une dynamique linéaire plus élevée et les longueurs d'onde inférieures donnent une meilleure sensibilité et activent l'analyse des protéines actuelles dans des concentrations inférieures.

Références

[Davantage de relevé : Chromatographie]

Last Updated: Feb 26, 2019

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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