Cromatografia di esclusione di dimensione (cromatografia d'esclusione)

La cromatografia di esclusione di dimensione (SEC) separa le componenti di un campione in base alla loro dimensione molecolare. L'esclusione o l'inclusione differenziale delle molecole è raggiunta via filtrazione attraverso un gel che contiene le perle sferiche. Queste perle hanno pori di una distribuzione per ampiezza specifica in modo da includere o escludere le molecole delle dimensioni differenti quando attraversano il gel.

Sec egualmente è conosciuta da altri nomi quali la cromatografia di esclusione, la cromatografia di cromatografia d'esclusione, la cromatografia liquida di esclusione e la cromatografia della permeazione del gel.

I principi di sec

La separazione di proteine e di altri composti in sec è raggiunta ha basato sulla dimensione delle molecole nel campione. La tecnica usa un gel che contiene le perle sferiche porose come il materiale da imballaggio nella colonna di cromatografia. Sulla base della distribuzione per ampiezza delle perle, le piccole molecole nel campione si diffondono nei pori dovuto cui il loro movimento è rallentato. Al contrario, le più grandi molecole non attraversano i pori, muoversi più rapidamente attraverso le perle e sono eluite. Quindi, le molecole sono separate in base alla loro dimensione lasciando la colonna per fare diminuire il peso molecolare.

I risultati ottenuti da questa a separazione basata a dimensione di molecole permettono che una curva di calibratura sia costruita. Ciò può essere usata per stimare il peso molecolare di una molecola sconosciuta nel campione permettendo al confronto con le proteine o i polimeri di peso molecolare conosciuto.

Il frazionamento e la desalificazione sono i due tipi comuni di separazioni effettuate facendo uso di sec.

Nella desalificazione delle proteine o degli acidi nucleici, il limite di esclusione del gel è tenuto più piccolo della dimensione della molecola di interesse. Così la molecola di interesse è eluita fuori mentre le più piccole molecole sono bloccate nei pori del gel.

Nel frazionamento è assicurato che le molecole di interesse facciano parte dell'intervallo del frazionamento del gel. Quindi, gli analiti che hanno pesi molecolari differenti sono separati dentro la matrice del gel.

I fattori che pregiudicano risoluzione in sec

La selezione del gel e le condizioni di gestione di sec possono variare secondo l'applicazione specifica.

Dimensioni della colonna

L'aumento di lunghezza della colonna aumenta la risoluzione e l'aumento nei risultati del diametro della colonna nell'alti volume di letto e quindi più su capacità della colonna. L'intervallo di frazionamento ed il limite di esclusione possono essere gestiti variando la dimensione del poro. Più piccola la dimensione delle particelle del gel, più alta la risoluzione raggiunta.

Portata

Ciò deve essere moderata per la migliore risoluzione. Ciò è perché le portate moderate danno abbastanza tempo alle molecole di usare l'intera area delle perle del gel nella fase stazionaria, che permette che le più piccole molecole richiedano tempo entrare nei pori. Ciò provoca la migliore separazione di molecole delle dimensioni differenti. La causa lenta di portate sopra la diffusione dei picchi e diminuisce così la risoluzione.

Imballaggio di colonna

Sia overpacking che underpacking possono essere nocivi al grado di risoluzione. La risoluzione egualmente drasticamente è influenzata dalla presenza di volume morto sopra la colonna mentre le molecole nel campione si diffondono prima di entrare nel letto della colonna, che provoca le vaste bande o gli più ampi picchi.

Metodo di rilevazione

UV è il modo più ampiamente usato di rilevazione e di misura delle proteine durante l'analisi di sec. Gli amminoacidi aromatici come triptofano rispondono meglio alle lunghezze d'onda UV o più lunghe vicine. Tuttavia, le più alte lunghezze d'onda offrono un'più alta gamma dinamica lineare e le lunghezze d'onda più basse danno la migliore sensibilità e permette all'analisi delle proteine presenti nelle concentrazioni basse.

Riferimenti

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Last Updated: Feb 26, 2019

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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