Cromatografia da exclusão do tamanho (filtragem de gel)

A cromatografia da exclusão do tamanho (SEC) separa componentes de uma amostra com base em seu tamanho molecular. A exclusão ou a inclusão diferencial das moléculas são conseguidas através da filtragem através de um gel que contenha grânulos esféricos. Estes grânulos têm os poros de uma distribuição de tamanho específica para incluir ou excluir moléculas de tamanhos diferentes quando passam através do gel.

O segundo é sabido igualmente por outros nomes tais como a cromatografia da exclusão, a cromatografia da filtragem de gel, a cromatografia líquida da exclusão, e a cromatografia da permeação do gel.

Os princípios de segundo

A separação de proteínas e de outros compostos no segundo é conseguida baseou no tamanho das moléculas na amostra. A técnica usa um gel que contenha grânulos esféricos porosos como o material de embalagem na coluna de cromatografia. Baseado na distribuição de tamanho dos grânulos, as moléculas pequenas na amostra difundem nos poros devido a qual seu movimento é retardado. Ao contrário, as moléculas maiores não passam através dos poros, para mover-se mais rapidamente através dos grânulos, e eluted. Assim, as moléculas são separadas com base em seu tamanho deixando a coluna por ordem de diminuir o peso molecular.

Os resultados obtidos desta separação tamanho-baseada de moléculas permitem que uma curva de calibração seja construída. Isto pode ser usado para calcular o peso molecular de uma molécula desconhecida na amostra permitindo a comparação com proteínas ou polímeros do peso molecular conhecido.

O fraccionamento e a dessalinização são os dois tipos comuns de separações realizadas usando o segundo.

Na dessalinização das proteínas ou de ácidos nucleicos, o limite de exclusão do gel é mantido menor do que o tamanho da molécula do interesse. Assim a molécula do interesse eluted para fora quando as moléculas menores forem prendidas nos poros do gel.

No fraccionamento assegura-se de que as moléculas do interesse caiam dentro da escala do fraccionamento do gel. Assim, os analytes que têm peso moleculares diferentes são separados dentro da matriz do gel.

Os factores que afetam a definição no segundo

A selecção do gel e as condições de funcionamento do segundo podem variar segundo a aplicação específica.

Dimensões da coluna

O aumento do comprimento da coluna aumenta a definição e o aumento em resultados do diâmetro da coluna no volume de base e daqui mais altamente na capacidade altos da coluna. A escala do fraccionamento e o limite de exclusão podem ser controlados variando o tamanho do poro. Menor o tamanho de partícula do gel, mais alta a definição conseguida.

Caudal

Isto precisa de ser moderado para a melhor definição. Isto é porque os caudais moderados dão bastante tempo às moléculas para utilizar a área de superfície inteira dos grânulos do gel na fase estacionária, que permite que as moléculas menores tomem o tempo entrar nos poros. Isto conduz à melhor separação de moléculas de tamanhos diferentes. A causa lenta dos flowrates sobre a difusão dos picos e reduz assim a definição.

Embalagem de coluna

Overpacking e underpacking podem ser prejudiciais ao grau de definição. A definição está afectada igualmente dràstica pela presença de volume inoperante sobre a coluna enquanto as moléculas na amostra difundem antes de entrar na base da coluna, que causa faixas largas ou uns picos mais largos.

Método da detecção

UV é o modo o mais amplamente utilizado de detecção e de medida das proteínas durante a análise do segundo. Os ácidos aminados aromáticos como o triptofano respondem melhor aos comprimentos de onda UV ou mais longos próximos. Contudo, uns comprimentos de onda mais altos oferecem um alcance dinâmico linear mais alto e uns mais baixos comprimentos de onda dão a melhor sensibilidade e permitem a análise das proteínas actuais em baixas concentrações.

Referências

Further Reading

Last Updated: Feb 26, 2019

Susha Cheriyedath

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Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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