Cromatografía de la exclusión de la talla (filtración de gel)

La cromatografía de la exclusión de la talla (SEC) separa componentes de una muestra en base de su talla molecular. La exclusión o la partícula extraña diferenciada de las moléculas se logra vía la filtración a través de un gel que contenga molduras esféricas. Estas molduras tienen poros de una distribución dimensional específica para incluir o excluir las moléculas de diversas tallas cuando pasan a través del gel.

El SEC también es sabido por otros nombres tales como cromatografía de la exclusión, cromatografía de la filtración de gel, cromatografía líquida de la exclusión, y cromatografía de la penetración a través de los poros del gel.

Los principios del SEC

La separación de proteínas y de otras composiciones en el SEC se logra basó en la talla de las moléculas en la muestra. La técnica utiliza un gel que contenga molduras esféricas porosas como el material de embalaje en la olumna de cromatografía. De acuerdo con la distribución dimensional de las molduras, las pequeñas moléculas en la muestra difunden en los poros debido a cuál se retrasa su movimiento. En cambio, las moléculas más grandes no pasan a través de los poros, moverse más rápidamente a través de las molduras, y se enjuagan. Así, las moléculas son separadas en base de su talla dejando la olumna en orden de disminuir el peso molecular.

Los resultados obtenidos de esta separación talla-basada de moléculas permiten que una curva de calibración sea construida. Esto se puede utilizar para estimar el peso molecular de una molécula desconocida en la muestra habilitando la comparación con las proteínas o los polímeros del peso molecular sabido.

El fraccionamiento y la desalación son los dos tipos comunes de separaciones realizadas usando el SEC.

En la desalación de proteínas o de ácidos nucléicos, el límite de exclusión del gel se mantiene más pequeño que la talla de la molécula del interés. Así la molécula del interés se enjuaga fuera mientras que moléculas más pequeñas se atrapan en los poros del gel.

En el fraccionamiento se asegura que las moléculas del interés caen dentro del alcance del fraccionamiento del gel. Así, los analitos que tienen diversos pesos moleculares se separan dentro de la matriz del gel.

Los factores que afectan a la resolución en el SEC

La selección del gel y las condiciones de funcionamiento del SEC pueden variar dependiendo del uso específico.

Dimensiones de la olumna

El aumento en largo de la olumna aumenta la resolución y el aumento en resultados del diámetro de la olumna en altos volumen de base y por lo tanto más arriba capacidad de la olumna. El alcance del fraccionamiento y el límite de exclusión pueden ser controlados variando talla del poro. Cuanto más pequeña es la talla de partícula del gel, más alta es la resolución lograda.

Flujo

Esto necesita ser moderado para la mejor resolución. Esto es porque los flujos moderados dan suficiente tiempo a las moléculas de hacer uso de la superficie entera de las molduras del gel en la fase estacionaria, que permite que moléculas más pequeñas tomen tiempo para entrar en los poros. Esto da lugar a una mejor separación de moléculas de diversas tallas. La causa lenta de los índices de corriente sobre la difusión de picos y reduce así la resolución.

Empaque de olumna

El overpacking y el underpacking pueden ser perjudiciales al grado de resolución. La resolución también es afectada drástico por la presencia de volumen muerto encima de la olumna mientras que las moléculas en la muestra difunden antes de entrar en la base de la olumna, que da lugar a bandas amplias o a picos más anchos.

Método de detección

ULTRAVIOLETA es la manera más ampliamente utilizada de la detección y de la medición de proteínas durante el análisis del SEC. Los aminoácidos aromáticos como el triptófano responden mejor a las longitudes de onda ULTRAVIOLETA o más largas cercanas. Sin embargo, longitudes de onda más altas ofrecen un rango dinámico lineal más alto y longitudes de onda más inferiores dan una mejor sensibilidad y habilitan el análisis de las proteínas presentes en concentraciones inferiores.

Referencias

[Lectura adicional: Cromatografía]

Last Updated: Feb 26, 2019

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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