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Microscopia di svuotamento dell'emissione stimolata (STED)

La microscopia di svuotamento dell'emissione stimolata (STED) è una tecnica (SR) di microscopia di fluorescenza di super-risoluzione che può sormontare il limite di diffrazione.

Credito di immagine: angellodeco/Shutterstock

Principi di STED

Concettualizzato nel 1990, era sei anni più successivamente all'università di Turku che l'inferno di Stephen ed i suoi colleghi hanno sviluppato la microscopia di STED.

Poichè STED può produrre la rappresentazione oltre il limite di diffrazione (il punto a cui le molecole di meno di 200 nanometro possono essere distinte l'uno dall'altro), le immagini super-risolte possono essere prodotte.

Questo insieme la tecnica oltre alle tecniche convenzionali di microscopia del ampio-campo come pure alla microscopia confocale, sopra cui la tecnica è basata.

Con microscopia confocale, l'illuminazione è raggiunta scandendo uno o più raggi laser attraverso un esemplare. Ciò permette che un'immagine (conosciuta come la sezione ottica) sia prodotta.

La tecnica ha permesso ai ricercatori di raccogliere i dati in vivo dagli esemplari e di raccogliere i dati tridimensionali. Sebbene la tecnica sia stata utile, non può da evitare l'emissione che altri moduli convenzionali della fronte di taglio di microscopia - non può superare il limite di diffrazione.

STED usa una simile impostazione a microscopia confocale. Usa due fasci laser. Uno per eccitare gli indicatori fluorescenti all'interno di un campione ed uno per svuotamento.

Il punto focale del raggio di eccitazione sovrappone il punto focale a forma di ciambella del raggio di svuotamento. Ciò permette all'ottimizzazione selettiva delle molecole all'interno di un campione o di un esemplare, tenendo conto la rappresentazione ad alta definizione.

Applicazioni di STED

Dal suo sviluppo, STED si è rivelato essere uno strumento potente per la ricerca biomedica. Con STED, la rappresentazione in tensione delle cellule è possibile con la fusione delle proteine fluorescenti verdi (GFP) alle proteine mirate a.

La struttura organizzativa all'interno dei vertici di Ranvier in neuroni è stata osservata facendo uso di STED. La disfunzione ai vertici di Ranvier è associata con lo sviluppo delle malattie neurodegenerative.

Ciò era un passo avanti significativo come apre la strada per gli studi futuri che più a fondo studieranno il collegamento fra l'organizzazione all'interno dei vertici di Ranvier ed i meccanismi patogeni connessi con le circostanze neurodegenerative.

Un modo di microscopia di STED, conosciuto come l'eccitazione STED del due-fotone, permette alla rappresentazione nei campioni di tessuto più spessi quali le fette del cervello. In uno dei primi usi di questa tecnica, le vescicole dei caveolae (un modulo della zattera del lipido) sono state etichettate facendo uso di GFP ed imaged.

Nel studiare le strutture o le interazioni multiple allo stesso tempo, STED multicolore (m-STED) è uno strumento utile. Ci sono vari modi di uso del m-STED, comunque alcuni possono essere costosi e complessi mentre i laser multipli devono essere utilizzati per raccogliere i risultati.

Sfide di microscopia di STED

La risoluzione assiale, anche conosciuta come risoluzione di profondità, può essere definita come la direzione parallela al raggio di ultrasuono. La risoluzione assiale è rimanere sempre un'emissione con l'uso di STED.

Coppia con microscopia 4Pi, questa emissione può essere sormontata come 4Pi ha risoluzione meglio assiale di volte 5-10 che un microscopio confocale convenzionale.

Photobleaching è un problema connesso con la vasta maggioranza delle tecniche dello SR. Tuttavia, questa sfida è particolarmente prevalente con l'uso di STED. L'imbianchimento degli indicatori fluorescenti è esacerbato dalle intensità aumentate dal raggio laser a forma di ciambella.

Quando STED è accoppiato con microscopia totale del riflesso (TIRF) interno, photobleaching può essere diminuito. TIRF come tecnica di microscopia è utilizzato agli indicatori fluorescenti di immagine negli ambienti acquosi che sono vicini ad una superficie solida come un vetro di coperchio che ha un alto indice analitico riflettente.

Questa altamente efficace tecnica produce la rappresentazione con pochi dalla fluorescenza del fuoco ed espone gli indicatori all'interno di un esemplare a meno leggero, diminuendo la possibilità di photobleaching.

Le tecniche dello SR come STED hanno causato uno spostamento tremendo in termini di risoluzione. Mentre le tecniche convenzionali hanno limitato che cosa potrebbe essere imaged, la microscopia più moderna dello SR ha permesso alle interazioni ed ai dettagli sottili dell'architettura cellulare da osservare.

Sebbene STED abbia il potenziale incredibile e varie applicazioni, il suo uso è spesso limitato dovuto il sui costo e complessità. Tuttavia, il desiderio della comunità di ricerca biomedica di avere migliori rappresentazioni certamente determinerà l'uso aumentato di STED in futuro.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Maryam Mahdi

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Maryam Mahdi

Maryam is a science writer with a passion for travel. She graduated in 2012 with a degree in Biomedical Sciences (B.Sc.) from the University of Manchester. Maryam previously worked in scientific education and has produced articles, videos, and presentations to highlight the association between dietary choices and cancer. She produces a range of articles for News-Medical, with a focus on microbiology and microscopy.

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