Microscopia ottica stocastica di ricostruzione (TEMPESTA)

La microscopia ottica stocastica di ricostruzione (TEMPESTA) è quella dei moduli più ampiamente usati di microscopia di super-risoluzione.

punto di vista di Super-risoluzione delle celleCredito di immagine: Micha Weber/Shutterstock

La microscopia convenzionale è limitata dal limite di diffrazione delle abbe di 250 nanometro. Ciò significa che soltanto gli oggetti più grandi di 250 nanometro possono essere risolti.

gli strumenti di Super-risoluzione hanno permesso di eliminare la barriera della diffrazione e di risolvere gli oggetti piccoli quanto 10−20 nanometro. INFURI, una delle tecniche di super-risoluzione inventate nel 2006, è basato su fluorophore photoswitchable o i fluorophores che emettono l'indicatore luminoso ai tempi differenti ed essi sono usati per risolvere l'immagine a tempo.

Principi di TEMPESTA

In un microscopio convenzionale, tutti i fluorophores in un campione sono fluorescenti piombo un'immagine regolare. Tuttavia, nel caso della TEMPESTA, ad un momento dato, soltanto alcuni fluorophores sono inseriti casualmente. Questi fluorophores ottengono candeggiati dopo un punto e si spostano allo stato scuro del `'. Poi, un altro insieme dei fluorophores è casualmente opzione sopra.

I fluorophores differenti si spostano fra gli stati leggeri e scuri ed in ogni istantanea di un'immagine, solo una piccola frazione è individuata. Il multiplo tali istantanee dei fluorophores differenti è catturato e poi sono tracciati per creare l'immagine definitiva di super-risoluzione.

Molecole fluorescenti di Photoswitchable

La molecola fluorescente è chiamata photoswitchable quando può essere convertita dentro in due stati differenti da indicatore luminoso brillante delle lunghezze d'onda differenti.

La proteina fluorescente gialla, o YFP, era la prima proteina photoswitchable in grado di spostarsi fra gli stati leggeri e scuri esponendo all'indicatore luminoso blu e viola. L'uso dei fluorophores photoswitchable è critico al principio di TEMPESTA ed i beni connessi con loro sono stati quotati.

Luminosità Fluorophore

Poichè la TEMPESTA conta sulla mappatura della ciascuna fluorophore ai tempi differenti e poi sul tracciato loro, la sua luminosità è critica alla tecnica. In ogni ciclo della rappresentazione, la posizione dei fluorophores essenzialmente è basata sul numero dei fotoni raccolti. Quindi, i fluorophores tenui saranno duri da individuare e possono ottenere candeggiati velocemente, pregiudicando la qualità di immagine.

Rapporto di contrasto

La TEMPESTA è basata sull'attivazione soltanto degli alcuni fluorophores per volta ed a qualsiasi punto dato, i fluorophores attivati saranno di meno che i fluorophores disattivati. La fluorescenza scura dello stato si riferisce alla fluorescenza emessa da un fluorophore quando è spenta. Ciò dovrebbe essere vicina a zero ottenere un segnale di alta qualità dai fluorophores che sono inseriti. Questo contrasto determina la qualità di immagine e di risoluzione ottenuta facendo uso della TEMPESTA.

Attivazione spontanea

L'attivazione spontanea è il fenomeno quando i fluorophores ottengono attivati senza esposizione all'indicatore luminoso della lunghezza d'onda d'attivazione. Quindi, in questo caso, i fluorophores che ottengono attivati da luce verde possono anche ottenere attivati da luce rossa brillante.

Questa attivazione non specifica può piombo al grande numero dei fluorophores che ottengono attivato al singolo stessi. Ciò sconfigge il principio di TEMPESTA, che è basata sull'attivazione del numero piccolo dei fluorophores ad un punto dato e poi sul tracciato di tutti i punti ottenuti insieme ai punti differenti per ottenere la maschera definitiva.

Rappresentazione di immagine

Ciò è il trattamento quando l'immagine definitiva è generata dopo la cattura della posizione dei fluorophores differenti dall'attivazione e dalla disattivazione. A questo punto, la posizione di ciascuno fluorophore è resa come intensità di punta e la sua larghezza è determinata dall'incertezza della localizzazione. I picchi di tutte le localizzazioni sono sommati insieme o tracciati per ottenere l'immagine definitiva dell'intensità del campione.

TEMPESTA multicolore

La TEMPESTA può anche essere usata simultaneamente all'immagine più di una struttura. Ciò è chiamata la rappresentazione multicolore. Per esempio, i beni foto-scambiabili di tre manifestazioni Cy5, CY5.5 e Cy7 delle tinture. Quindi, le molecole differenti possono essere etichettate simultaneamente con le tre tinture ed imaged per ottenere un'immagine super-risolta multicolore.

TEMPESTA 3D

Oltre ad ottenere le immagini bidimensionali, questa tecnica egualmente è stata sfruttata per ottenere le immagini tridimensionali. Questi beni sono per quanto la maggior parte delle strutture cellulari viventi siano critiche tridimensionali e così devono essere osservate in tutte le asce. Le modifiche secondarie al metodo della TEMPESTA possono essere impiegate per estendere il suo modulo bidimensionale.

Sorgenti:

[Ulteriore lettura: microscopia di Super-risoluzione]

Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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