Microscopia óptica estocástica da reconstrução (TEMPESTADE)

A microscopia óptica estocástica da reconstrução (TEMPESTADE) é esse dos formulários os mais amplamente utilizados da microscopia da super-definição.

ideia da Super-definição das pilhasCrédito de imagem: Micha Weber/Shutterstock

A microscopia convencional é limitada pelo limite de difracção do Abbe de 250 nanômetro. Isto significa que somente os objetos maiores de 250 nanômetro podem ser resolved.

as ferramentas da Super-definição tornaram possível quebrar a barreira da difracção e resolver os objetos tão pequenos quanto 10−20 nanômetro. ATAQUE, uma das técnicas da super-definição inventadas em 2006, é baseado em fluoróforo photoswitchable ou os fluorophores que se emitem a luz em horas diferentes e são usados para resolver a tempo a imagem.

Princípios de TEMPESTADE

Em um microscópio convencional, todos os fluorophores em uma amostra são fluorescentes conduzindo uma imagem lisa. Contudo, em caso da TEMPESTADE, em um momento dado, somente alguns fluorophores são ligados estocàstica. Estes fluorophores obtêm descorados após um ponto e deslocam ao estado escuro do `'. Então, um outro grupo de fluorophores é estocàstica interruptor sobre.

Os fluorophores diferentes deslocam entre estados claros e escuros e em cada instantâneo de uma imagem, simplesmente uma fracção pequena é detectada. O múltiplo tais instantâneos de fluorophores diferentes é tomado e são traçados então criar a imagem final da super-definição.

Moléculas fluorescentes de Photoswitchable

A molécula fluorescente está chamada photoswitchable quando pode ser convertida dentro a dois estados diferentes brilhando a luz de comprimentos de onda diferentes.

A proteína fluorescente amarela, ou YFP, eram a primeira proteína photoswitchable que poderia deslocar entre estados claros e escuros expor à luz azul e violeta. O uso de fluorophores photoswitchable é crítico ao princípio de TEMPESTADE e as propriedades associadas com eles foram alistadas.

Brilho fluoróforo

Porque a TEMPESTADE confia em traçar cada um fluoróforo em horas diferentes e então nas traçar, seu brilho é crítico à técnica. Em cada ciclo da imagem lactente, a posição dos fluorophores é baseada essencialmente no número de fotão recolhidos. Assim, os fluorophores não ofuscantes serão duros de detectar e podem obter descorados rapidamente, afetando a qualidade da imagem.

Relação do contraste

A TEMPESTADE é baseada em ativar somente alguns fluorophores de cada vez e em algum ponto dado, os fluorophores ativados serão menos do que os fluorophores desativados. A fluorescência escura do estado refere a fluorescência emissora de um fluoróforo quando é desligada. Isto deve ser próximo a zero obter um sinal de alta qualidade dos fluorophores que são ligados. Este contraste determina a qualidade da definição e da imagem obtida usando a TEMPESTADE.

Activação espontânea

A activação espontânea é o fenômeno quando os fluorophores obtêm ativados sem exposição à luz do comprimento de onda de activação. Assim, neste caso, os fluorophores que obtêm ativados pela luz verde podem igualmente obter ativados brilhando a luz vermelha.

Esta activação não específica pode conduzir ao grande número de fluorophores que obtêm ativado no único mesmos. Isto derrota o princípio de TEMPESTADE, que é baseada em ativar o número pequeno de fluorophores em um ponto dado e então em traçar todos os pontos obtidos em pontos diferentes junto para obter a imagem final.

Rendição da imagem

Este é o processo quando a imagem final é gerada após ter capturado o lugar de fluorophores diferentes pela activação e pela desactivação. Nesta etapa, o lugar de cada um fluoróforo é rendido como a intensidade máxima, e sua largura é determinada pela incerteza da localização. Os picos de todas as localizações são somados ou traçados junto obter a imagem final da intensidade da amostra.

TEMPESTADE multicolorido

A TEMPESTADE pode igualmente ser usada à imagem mais de uma estrutura simultaneamente. Isto é chamado multi - imagem lactente da cor. Por exemplo, propriedades foto-switchable de três mostras Cy5, CY5.5, e Cy7 das tinturas. Assim, as moléculas diferentes podem ser etiquetadas com as três tinturas e imaged simultaneamente para obter uma imagem super-resolved multicolorido.

TEMPESTADE 3D

Independentemente de obter imagens bidimensionais, esta técnica foi explorada igualmente para obter imagens tridimensionais. Esta propriedade é por mais críticas que a maioria de estruturas celulares vivas sejam tridimensionais e precisem assim de ser vistas em todos os machados. As alterações menores ao método da TEMPESTADE podem ser empregadas para estender seu módulo bidimensional.

Fontes:

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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