Microscopia óptica estocástica de la reconstrucción (TORMENTA)

La microscopia óptica estocástica de la reconstrucción (TORMENTA) es la que está de las formas más ampliamente utilizadas de la microscopia de la estupendo-resolución.

opinión de la Estupendo-resolución de célulasHaber de imagen: Micha Weber/Shutterstock

La microscopia convencional es limitada por el límite de la difracción del Abbe de 250 nanómetro. Esto significa que solamente los objetos más grandes de 250 nanómetro pueden ser resueltos.

las herramientas de la Estupendo-resolución han permitido romper la barrera de la difracción y resolver los objetos tan pequeños como 10−20 nanómetro. ASALTE, una de las técnicas de la estupendo-resolución inventadas en 2006, se basa en fluoróforo photoswitchable o los fluorophores que emiten la luz en diversas horas y ellos se utilizan para resolver la imagen a tiempo.

Principios de la TORMENTA

En un microscopio convencional, todos los fluorophores en una muestra son fluorescentes llevando una imagen lisa. Sin embargo, en caso de TORMENTA, en un punto del tiempo dado, solamente se encienden algunos fluorophores estocástico. Estos fluorophores consiguen blanqueados después de un punto y cambio al estado oscuro del `'. Entonces, otro equipo de fluorophores es estocástico interruptor conectado.

Diversos fluorophores cambio entre los estados livianos y oscuros y en cada foto de una imagen, sólo se descubre una pequeña fracción. Se toma el múltiplo tales fotos de diversos fluorophores y entonces se trazan para crear la imagen final de la estupendo-resolución.

Moléculas fluorescentes de Photoswitchable

La molécula fluorescente se llama photoswitchable cuando puede ser convertida hacia adentro a dos diversos estados por la luz brillante de diversas longitudes de onda.

La proteína fluorescente amarilla, o YFP, era la primera proteína photoswitchable que podría cambio entre los estados livianos y oscuros exponiendo a la luz azul y violeta. El uso de fluorophores photoswitchable es crítico al principio de la TORMENTA y las propiedades asociadas a ellos se han enumerado.

Luminosidad fluorófora

Pues la TORMENTA confía en la correspondencia de cada uno fluorófora en diversas horas y después el trazado de ellas, su luminosidad es crítica a la técnica. En cada ciclo de la proyección de imagen, la posición de fluorophores esencialmente se basa en el número de fotones cerco. Así, los fluorophores oscuros serán duros de descubrir y pueden conseguir blanqueados rápidamente, afectando a la calidad de la imagen.

Coeficiente de contraste

La TORMENTA se basa en activar solamente algunos fluorophores al mismo tiempo y en cualquier punto dado, los fluorophores activados serán menos que los fluorophores desactivados. La fluorescencia oscura del estado refiere a la fluorescencia emitida de un fluoróforo cuando se apaga. Esto debe estar cercano a cero obtener una señal de alta calidad de los fluorophores se encienden que. Este contraste determina la calidad de la resolución y de la imagen obtenida usando TORMENTA.

Activación espontánea

La activación espontánea es el fenómeno cuando los fluorophores consiguen activados sin la exposición a la luz de la longitud de onda que activa. Así, en este caso, los fluorophores que consiguen activados por la luz verde pueden también conseguir activados por la luz roja brillante.

Esta activación no específica puede llevar al gran número de fluorophores que consiguen activado en el único lo mismo. Esto derrota el principio de la TORMENTA, que se basa en activar el pequeño número de fluorophores en un punto dado y después el trazado de todos los puntos obtenidos en diversos puntos juntos para conseguir el retrato final.

Representación de la imagen

Éste es el proceso cuando la imagen final es generada después de capturar la situación de diversos fluorophores por la activación y la desactivación. En este paso, la situación de cada uno fluoróforo se rinde como intensidad máxima, y su anchura es determinada por la incertidumbre de la localización. Los picos de todas las localizaciones se suman o se trazan juntos para conseguir la imagen final de la intensidad de la muestra.

TORMENTA multicolora

La TORMENTA se puede también utilizar a la imagen más de una estructura simultáneamente. Esto se llama proyección de imagen multicolora. Por ejemplo, propiedades foto-cambiables de tres demostraciones Cy5, CY5.5, y Cy7 de los tintes. Así, diversas moléculas se pueden marcar con etiqueta con los tres tintes y reflejado simultáneamente para conseguir una imagen estupendo-resuelta multicolora.

TORMENTA 3D

Aparte de la obtención de imágenes bidimensionales, esta técnica también se ha explotado para conseguir imágenes tridimensionales. Esta propiedad es tan críticas que la mayoría de las estructuras celulares vivas son tridimensionales y necesitan así ser vistas en todas las hachas. Las modificaciones de menor importancia al método de la TORMENTA se pueden emplear para ampliar su módulo bidimensional.

Fuentes:

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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