Microscopia da Super-Definição contra a microscopia de elétron

Faixa clara a:

A fotomicroscopia convencional tem seus limites. Ilumine, sendo uma onda, seja sujeito à difracção que limita severamente o tamanho das estruturas uma pode resolver. Para poder observar partes de um organismo menor do que este, outras técnicas precisam de ser empregadas.

Os tipos de microscopia empregados (permitindo que o usuário ver coisas como moléculas e organelles no detalhe alto) caem em duas categorias: microscopia da super-definição (SRM) e microscopia de elétron (EM). SRM e o EM são ferramentas úteis para a pesquisa, cumprindo papéis diferentes em um projecto.

A proteína de sinalização Fyn que move e que forma conjuntos nos neurónios vivos - vistos usando a microscopia da super-definição. Crédito de imagem: Laboratório do Meunier, universidade de Queensland
A proteína de sinalização Fyn que move e que forma conjuntos nos neurónios vivos - vistos usando a microscopia da super-definição. Crédito de imagem: Laboratório do Meunier, universidade de Queensland

Microscopia da Super-Definição

SRM abrange uma variedade de métodos. Alguns deles são alistados aqui, mas há outras técnicas que podem ser utilizadas por um laboratório.

Microscopia óptica estocástica da reconstrução (TEMPESTADE)
Este é o método o mais de uso geral de SRM. A TEMPESTADE usa fluorophores photoswitchable para gerar imagens de alta resolução. A rotulagem específica é exigida então para conseguir uma imagem multicolour de alta qualidade. Um sistema aperfeiçoado da TEMPESTADE pode gerar imagens com uma definição de 5 nanômetro, fotomicroscopia muito mais altamente do que apenas.

Uma imagem spectrally resolvida da microscopia da super-definição de quatro alvos subcelulares que foram etiquetados por quatro tinturas distante-vermelhas na separação espectral de 10 nanômetro. A cor é usada para indicar a posição medida da emissão da fluorescência de cada única molécula. (Barra da escala: 1 μm). Crédito de imagem: Laboratório do KE Xu/Berkeley
Uma imagem spectrally resolvida da microscopia da super-definição de quatro alvos subcelulares que foram etiquetados por quatro tinturas distante-vermelhas na separação espectral de 10 nanômetro. A cor é usada para indicar a posição medida da emissão da fluorescência de cada única molécula. (Barra da escala: 1 μm). Crédito de imagem: Laboratório do KE Xu/Berkeley

Microscopia estruturada da iluminação (SIM)
Esta técnica envolve amostras illuminating com o software especializado claro e usando-se modelado para analisar a informação. A dobra das definições 2 mais altamente do que o limite de difracção pode ser obtida usando o software da reconstrução. A vantagem principal de SIM sobre outros métodos de SRM é que pode umas secções mais grossas da imagem, que é útil para 3D e imagem lactente da vivo-pilha.

Ainda imagem de um vídeo que mostra a interacção do actínio filamentous (mApple-F-tractin, roxa) com grupos principais bipolares do myosin IIA (EGFP, myosin IIA, verde) em 20 segundos intervalos para 100 pontos do tempo, como visto com alto-NA TIRF-SIM. Crédito de imagem: Laboratório de Betzig, terreno da pesquisa de HHMI/Janelia
Ainda imagem de um vídeo que mostra a interacção do actínio filamentous (mApple-F-tractin, roxa) com grupos principais bipolares do myosin IIA (EGFP, myosin IIA, verde) em 20 segundos intervalos para 100 pontos do tempo, como visto com microscopia TIRF-estruturada alto-NA da iluminação. Crédito de imagem: Laboratório de Betzig, terreno da pesquisa de HHMI/Janelia

Prostração da emissão estimulada (STED)
STED é uma técnica que use um par de pulsos do laser para excitar e de-excitar fluorophores; o efeito é localizar a fluorescência em pontos focais. As imagens são criadas então usando a exploração de quadriculação. Embora esta técnica tem uma velocidade lenta da aquisição para grandes campos de vista, a técnica tem uma grande profundidade da imagem lactente do µm 10-15, permitindo que as imagens com uma alta resolução sejam produzidas.

excitação do Dois-fotão (TPE)
A vantagem principal do TPE é que causa menos fototoxicidade do que a microscopia de exploração do laser (CLSM) ou a microscopia de exploração confocal do laser (LCSM). Ao contrário na microscopia de fluorescência convencional, onde a luz da excitação têm um comprimento de onda menor (isto é uma energia mais alta) do que a luz da fluorescência, do TPE dos usos a luz infra-vermelha geralmente no fluxo alto, e a fluorescência é observada no caso de uma absorção do dois-fotão - em um comprimento de onda mais curto do que a luz infravermelha do excitador, desde que a energia combinada de dois fotão do excitador tinha sido absorvida. O TPE foi usado na aplicação diversa com pilhas vivas, incluindo a organização cytoskeletal e a detecção reactiva do oxigênio.

Embora têm vantagens óbvias sobre a fotomicroscopia para a análise de estruturas celulares, os vários tipos de SRM têm suas limitações.

Os produtos manufacturados podem ainda existir na reconstrução da imagem, photobleaching pode ocorrer, e o uso do equipamento especializado e de tinturas fluorescentes pode fazer estes processos caros.

Pode tomar uns muitos tempos reconstruir as imagens com algumas técnicas, uma adição mais adicional ao custo dos projectos de investigação.

a microscopia da Super-definição, enquanto pode permitir que o observador espreite mais profundamente na natureza, não pode ser usada a nível molecular.

Para este tipo de pesquisa, há uma ferramenta ainda mais poderosa disponível aos cientistas que esteja ao redor desde o século 20th adiantado: Microscopia de elétron.

Microscopia de elétron

Desenvolvida em 1926, a microscopia de elétron trabalha despedindo um feixe de elétrons concentrados em uma amostra.

A vantagem principal desta técnica é que as estruturas podem ser analisadas no detalhe minúsculo, como a definição das imagens que estão produzidas usando a microscopia de elétron está na escala de para baixo a 0,2 nanômetros, 1000x mais detalhado do que é conseguido com fotomicroscopia convencional, e muito mais altamente do que com técnicas de SRM.

Com EM, os cientistas podem olhar os nanostructures que não seriam visíveis de outra maneira, e distinguem suas propriedades.

Há dois tipos principais de microscopia de elétron:

Microscopia de elétron de transmissão (TEM)
Usado para ver espécimes finos (tais como secções do tecido) passando elétrons através delas e criando uma imagem. Se uma amostra absorve ou dispersa elétrons, o lugar parecerá escuro na imagem de TEM, quando se uma amostra não interage com os feixes de elétron um ponto brilhante ocorrer dos elétrons transmitidos. Desta maneira, TEM é análogo à fotomicroscopia convencional, embora usa elétrons um pouco do que a luz e tem um distante mais de alta resolução.

Microscopia de elétron de transmissão no Klebsiella vitro-cultivado (Kp-2H7). Crédito de imagem: Alessia Ranciaro
Microscopia de elétron de transmissão (TEM) no Klebsiella vitro-cultivado (Kp-2H7). Crédito de imagem: Alessia Ranciaro

Microscopia de elétron da exploração (SEM)
SEM cria imagens fazendo a varredura de uma superfície com um feixe de elétron focalizado e detectando os elétrons backscattered. O contrário a TEM, um lugar que disperse fortemente elétrons parecerá brilhante, quando as amostras que não interagem com o feixe de elétron permanecerem escuras. Esta técnica fornece detalhes de pilhas e de superfícies inteiras, algo que não é realizável com TEM.

Um vaso sanguíneo (centro) fornece nutrientes essenciais a um tumor da melanoma (saiu) nesta imagem artificial colorized da microscopia. Imagem DOI: os pesquisadores 10.7295W9CIL38960 na universidade do Tóquio estudaram um receptor da membrana de pilha, LRP1, e uma enzima, tPA, para seus papéis na metástase da melanoma nos ratos. Crédito de imagem: Imagens CC-BY-NC-ND http://www.cellimagelibrary.org/images/38960 de Wellcome
Um vaso sanguíneo (centro) fornece nutrientes essenciais a um tumor da melanoma (saiu) nesta imagem artificial colorized da microscopia. Imagem DOI: os pesquisadores 10.7295W9CIL38960 na universidade do Tóquio estudaram um receptor da membrana de pilha, LRP1, e uma enzima, tPA, para seus papéis na metástase da melanoma nos ratos. Crédito de imagem: Imagens CC-BY-NC-ND http://www.cellimagelibrary.org/images/38960 de Wellcome

Desvantagens da microscopia de elétron

A microscopia de elétron, embora uma ferramenta poderosa, tem seus inconvenientes. O facto de que os elétrons podem facilmente ser deflexionados por moléculas no ar significa que os espécimes devem ser realizados em um vácuo.

Isto significa que a microscopia de elétron não pode ser usada para analisar espécimes e estruturas vivos (visto que determinadas técnicas de SRM enlatam), que apresenta dificuldades para a análise biológica.

As amostras devem ser preservadas de modo que representar de tão perto quanto possível as estruturas de vida, que podem ser caras e demoradas.

Também, a natureza especializada das técnicas exige operadores altamente qualificados, e os produtos manufacturados da preparação da amostra são comuns.

SRM contra o EM: Duas ferramentas poderosas para o pesquisador

Este artigo foi uma breve introspecção na super-definição e na microscopia de elétron, esboçando seus pontos fortes e fracos. Ambos são adições ao laboratório e complementares fortes na informação que fornecem.

Ambos os tipos de microscopia compartilham que ultrapassam as limitações da definição da fotomicroscopia.

Para estudos das ciências da vida, SRM e o EM podem resolver estruturas celulares e para permitir assim as introspecções profundas na pilha funcionam.

Quando SRM permitir cientistas de estudar dinâmicamente a arquitetura da pilha em pilhas vivas, a definição é geralmente mais baixa do que com microscopia de elétron. Contudo, o EM exige a fixação da amostra e é assim um método para estudar arquiteturas da pilha em amostras devida.

Para realizar estudos eficazes, os laboratórios e seu pessoal devem ser seguros e conhecedors na aplicação destas técnicas, e atualizados nas revelações as mais atrasadas neste campo científico.

Quem sabe que avanços o futuro pode guardarar?

Fontes

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Last Updated: Sep 20, 2019

Reginald Davey

Written by

Reginald Davey

Reg Davey is a freelance copywriter and editor based in Nottingham in the United Kingdom. Writing for News Medical represents the coming together of various interests and fields he has been interested and involved in over the years, including Microbiology, Biomedical Sciences, and Environmental Science.

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