La bioluminescenza è un'emissione di indicatore luminoso prodotta quando il luciferase degli enzimi catalizza l'ossidazione di suo substrato, luciferin.
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L'istanza più ben nota di bioluminescenza è l'indicatore luminoso prodotto dalle lucciole. Il luciferase della lucciola è stato sfruttato per la ricerca biologica coppia la reazione di luciferase con altre analisi enzimatiche.
Alcuni sforzi sono stati fatti per utilizzare la bioluminescenza in animali vivi, ma il substrato di luciferin della lucciola, D-luciferin, ha la permeabilità bassa del tessuto ed affinità difficile per il luciferase. Egualmente non attraversa la barriera ematomeningea, che limiti l'applicabilità agli studi del cervello.
Le alternative sintetiche al sistema di luciferase della lucciola sono state sviluppate per sormontare le limitazioni di questa analisi.
Analoghi di Luciferin
Un analogo sintetico di D-luciferin, chiamato AkaLumine, produce l'indicatore luminoso nell'intervallo vicino all'infrarosso, a 677 nanometro. Questa lunghezza d'onda può penetrare gli organismi ed i tessuti della maggior parte dei animali. Ulteriormente, AkaLumine distribuisce bene ai tessuti dell'organismo ed agli organi profondi, a differenza di D-luciferin.
I ricercatori hanno creato un sistema sintetico di bioluminescenza basato su AkaLumine modificando il gene di luciferase con evoluzione diretta. Ciò li ha permessi al sistema sintetico di bioluminescenza dell'AT. "A" che potrebbe essere utilizzato nei tessuti dell'animale vivo.
Il sistema risultante ha prodotto un segnale di bioluminescenza 1000 volte più forti del luciferase della lucciola nel cervello del mouse. Egualmente è stato indicato per permettere che i ricercatori osservino le diverse celle d'ardore in polmone del mouse.
Un'altra alternativa a D-luciferin è CyclLuc1. CycLuc1 è un aminoluciferin che ha un anello cinque-membered fuso di indoline. Questa molecola ha beni superiori a D-luciferin in vivo, che significa che meno substrato è richiesto per la rappresentazione e un output leggero più intenso e più persistente sia prodotto.
CycLuc1 attraversa prontamente la barriera ematomeningea e può essere usato per accedere ai tessuti cerebrali profondi. Uno spostamento verso il rosso dei fotoni emessi è creduto per contribuire all'intensità migliore di indicatore luminoso prodotta da CycLuc1.
CycLuc1 può essere sostituito semplicemente per D-luciferin nelle analisi di bioluminescenza. Altri aminoluciferins sperimentali sono stati sviluppati. CycLuc1 e CycLuc2 hanno fuso gli anelli cinque-membered. CycLuc3 e CycLuc4 hanno fuso gli anelli sei-membered di oxazine.
CycLuc5 e CycLuc6 sono stati destinati per emettere l'indicatore luminoso alle lunghezze d'onda più lunghe. Hanno i 2,2,4 gruppi trimetilici-dihydroquinoline che induce uno spostamento verso il rosso nei fluorophores, quali i coumarins e i oxazines. Almeno 12 di questi aminoluciferins sintetici sono stati creati.
Mutanti di Luciferase
Il luciferase della lucciola ha un alto livello di plasticità strutturale ed accetterà una grande selezione delle molecole come substrati. Gli scienziati hanno trovato che una combinazione di tre mutazioni attive del sito del gene di luciferase della lucciola (R218K, L286M e S347A) ha prodotto un luciferase con una selettività di 10.000 volte per un substrato sintetico di luciferin sopra il substrato naturale, D-luciferin.
Le tre mutazioni dell'enzima lo rendono inattivo con D-luciferin. CycLuc7 è stato trovato per essere il substrato ottimale per il luciferase del triplo-mutante in vitro.
Il luciferase mutante essenzialmente elimina l'output leggero dal substrato indigeno di D-luciferin mentre conserva o migliorando l'emissione di luce da uno o più substrati sintetici di luciferin in celle in tensione. I luciferins sintetici e i luciferases mutanti ampliano significativamente l'intervallo delle opzioni per in vivo e delle analisi in vitro.
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