La reazione a catena della polimerasi

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica di laboratorio rivoluzionaria che permette alla replica di una sequenza specifica del DNA. Facendo uso della PCR, milioni di copie di un DNA dell'obiettivo possono essere sintetizzati facilmente durante un corto periodo di tempo.

È un basso costo relativamente e una tecnica sensibile che ha aperto la strada per la terra-rottura la ricerca genetica e dei sistemi diagnostici nel corso degli anni. Dal suo arrivo negli anni 80, questa tecnica ha trovato varie applicazioni nelle discipline scientifiche innumerevoli, grazie alla sua specificità e la versatilità.

Componenti della PCR

Modello del DNA

Il DNA del campione che contiene la sequenza dell'obiettivo.

DNA polimerasi

L'enzima che sintetizza il DNA fresco incaglia complementare alla sequenza del DNA dell'obiettivo. La DNA polimerasi di Taq è la polimerasi più comunemente usata nella PCR. Taq si riferisce al aquaticus di Thermus, un microrganismo termofilo da cui questa DNA polimerasi termoresistente è estratta.

La polimerasi di Taq può essere stabile alle temperature alte quanto 95oC, rendentegli l'ideale per la PCR. Un altro organismo comunemente usato è la DNA polimerasi di Pfu, ha trovato nel furiosus termostabile di Pyrococcus dell'organismo. Gli entrambi enzimi sono capaci della generazione dei fili nuovi del DNA facendo uso delle mani di fondo e di un modello del DNA.

Mani di fondo

I segmenti minuscoli di DNA unico incagliato che aiutano la DNA polimerasi per iniziare la sintesi di nuovo DNA si incaglia. Le mani di fondo sono complementari alla sequenza del DNA dell'obiettivo.

Nucleotidi

La persona basa A, T, il G e la C, che sono le particelle elementari di DNA. Fungono da materia prima per la nuova sintesi del DNA.

Buffer (solitamente MgCl2)

Una soluzione salina usata per stabilizzare le componenti di reazione, particolarmente il DNA e per mantenere un pH ottimale durante la reazione.

Acqua (deionizzata)

Fornisce l'ambiente liquido stato necessario per la reazione a catena.

Punti chiave nella PCR

Denaturazione del DNA

Una temperatura elevata di 95°C si applica al DNA a doppia elica originale. Denatura al calore il DNA suddividendo i sui legami idrogeni deboli. Quindi, il DNA a doppia elica separa provocare il singolo DNA incagliato.

Ricottura della mano di fondo

Il DNA denaturato è raffreddato a 45 - 72°C permettendo che le mani di fondo leghino alla loro sequenza complementare nel singolo DNA incagliato dell'obiettivo. La temperatura di ricottura è un fattore cruciale poichè l'ibridazione di DNA è un trattamento temperatura-dipendente. Se questa temperatura è troppo alta l'accoppiamento del mano di fondo-modello non accadrà, così ostacolando la reazione a catena.

Estensione della mano di fondo

La miscela poi è riscaldata a 72°C, a cui la DNA polimerasi comincia aggiungere i nucleotidi alla mano di fondo facendo uso del DNA dell'obiettivo come modello ed estende la mano di fondo con conseguente nuova formazione del DNA.

Ripeti punto 1

Ai i 3 punti superiori sono ripetuti circa 30 volte per l'amplificazione del DNA formato di recente. Per ogni nuovo ciclo, il DNA formato nei cicli precedenti egualmente servisce da modello e quindi l'amplificazione è esponenziale.

Tipi di PCR

Ci sono stati parecchi adattamenti della PCR standard col passare del tempo. Alcune delle varianti chiave della PCR sono citate qui sotto:

PCR inversa della trascrizione (RT-PCR)

Permette la produzione dei modelli del DNA che corrispondono ad un campione del RNA con l'aiuto di un enzima chiamato transcriptase inverso.

PCR in tempo reale

Una variante avanzata della PCR dove l'intera reazione a catena è riflessa e dei dati è riunita in tempo reale.

PCR multipla

Permette l'amplificazione simultanea di numerosi campioni del DNA

PCR intercalata

Usato per aumentare la specificità del DNA ampliato e per diminuire associazione non specifica delle mani di fondo.

PCR asimmetrica

Permette l'amplificazione di soltanto un filo del DNA a doppia elica originale

PCR in situ

PCR effettuata nella cella o un tessuto fissato ad una diapositiva

Riferimenti

[Ulteriore lettura: Reazione a catena della polimerasi]

Last Updated: Aug 23, 2018

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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