A reacção em cadeia da polimerase

A reacção em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica de laboratório revolucionária que permita a réplica de uma seqüência específica do ADN. Usando o PCR, milhões de cópias de um ADN do alvo podem facilmente ser sintetizados dentro de um curto período de tempo.

É um custo relativamente baixo e uma técnica sensível que pavimente a maneira para a pesquisa genética inovador e os diagnósticos ao longo dos anos. Desde seu advento nos anos 80, esta técnica encontrou uma variedade de aplicações em disciplinas científicas inumeráveis, agradecimentos a sua especificidade e versatilidade.

Componentes do PCR

Molde do ADN

O ADN da amostra que contem a seqüência do alvo.

Polimerase de ADN

A enzima que sintetiza o ADN fresco encalha complementar à seqüência do ADN do alvo. A polimerase de ADN de Taq é a polimerase a mais de uso geral no PCR. Taq refere o aquaticus de Thermus, um micro-organismo thermophilic de que esta polimerase de ADN resistente ao calor é extraído.

A polimerase de Taq pode ser estável nas temperaturas tão altas quanto 95oC, fazendo lhe o ideal para o PCR. Um outro organismo de uso geral é a polimerase de ADN de Pfu, encontrou no calor - furiosus estável de Pyrococcus do organismo. Ambas as enzimas são capazes de gerar costas novas do ADN usando primeiras demão e um molde do ADN.

Primeiras demão

Os segmentos minúsculos do ADN único-encalhado que ajudam a polimerase de ADN a iniciar a síntese do ADN novo encalham. As primeiras demão são complementares à seqüência do ADN do alvo.

Nucleotides

O indivíduo baseia A, T, G, e C, que são os blocos de apartamentos de ADN. Actuam como a matéria prima para a síntese nova do ADN.

Amortecedor (geralmente MgCl2)

Uma solução de sal usada para estabilizar os componentes da reacção, especialmente o ADN, e para manter um pH óptimo durante a reacção.

Água (deionized)

Fornece o ambiente líquido necessário para a reacção em cadeia.

Etapas chaves no PCR

Desnaturação do ADN

Uma alta temperatura de 95°C é aplicada dobro original ao ADN encalhado. O calor desnatura o ADN dividindo suas ligações de hidrogênio fracas. Assim, o ADN encalhado dobro separa causar o único ADN encalhado.

Recozimento da primeira demão

O ADN desnaturado é refrigerado para baixo a 45 - 72°C permitindo que as primeiras demão liguem a sua seqüência complementar no único ADN encalhado do alvo. A temperatura do recozimento é um factor crucial porque a hibridação do ADN é um processo temperatura-dependente. Se esta temperatura é demasiado alta o emparelhamento do primeira demão-molde não acontecerá, assim impedindo a reacção em cadeia.

Extensão da primeira demão

A mistura é então caloroso a 72°C, em que a polimerase de ADN começa adicionar nucleotides à primeira demão usando o ADN do alvo como um molde e estende a primeira demão tendo por resultado a formação nova do ADN.

Repita etapa 1

As 3 etapas acima são repetidas aproximadamente 30 vezes para a amplificação do ADN recentemente formado. Para cada ciclo novo, o ADN formado nos ciclos precedentes igualmente serve como um molde e conseqüentemente a amplificação é exponencial.

Tipos de PCR

Houve diversas adaptações do PCR padrão ao longo do tempo. Algumas das variações chaves do PCR são mencionadas abaixo:

PCR reverso da transcrição (RT-PCR)

Permite a produção de moldes do ADN que correspondem a uma amostra do RNA com a ajuda de uma enzima chamada transcriptase reverso.

PCR do tempo real

Uma variação avançada do PCR onde a reacção em cadeia inteira é monitorada e dos dados é recolhida no tempo real.

PCR multiplex

Permite a amplificação simultânea de amostras numerosas do ADN

PCR aninhado

Usado para aumentar a especificidade do ADN amplificado e para reduzir o emperramento não específico das primeiras demão.

PCR assimétrico

Permite a amplificação de somente uma costa do ADN encalhado dobro original

PCR in situ

PCR realizado na pilha ou um tecido fixado a uma corrediça

Referências

Further Reading

Last Updated: Aug 23, 2018

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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