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Applications totales de microscopie à fluorescence de réflexion (TIRF) interne

La microscopie totale de fluorescence de réflexion interne (habituellement abrégée comme TIRF) est une technique d'imagerie qui illumine la fluorescence dans un endroit peu profond du spécimen afin d'améliorer le rapport signal/bruit. Cette technique est largement appliquée en petites structures ou molécules de représentation.

Cellules cancéreuses illuminées par microscopie à fluorescence - par Caleb adoptif

Caleb adoptif | Shutterstock

Méthodologie de microscopie de TIRF

Dans la microscopie de TIRF, les molécules fluorescentes sont dans un échantillon dans un milieu aqueux qui est près d'un solide avec un indice de réfraction de haut, habituellement une lamelle en verre. À ce qui est appelée la cornière critique, l'illumination est totalement réfléchie hors de la surface adjacente entre la glace et le liquide. Cette réflexion produit un champ électromagnétique mince appelé l'onde évanescente.

L'onde évanescente a excité des fluorophores à moins de 100-200 nanomètre de la lamelle en verre. Cet inducteur mince est important pour trois raisons : le rapport de signe-à-mouvement propre est haut, la fluorescence très petite qui est hors focale est rassemblée, et pour finir, la lumière que des cellules sont exposées à est essentiellement moins que des techniques traditionnelles de microscopie.

Applications fondamentales de microscopie de TIRF

La microscopie de TIRF a été au commencement développée pendant les années 1980, mais n'a pas été employée beaucoup jusque récemment. Dans les premiers temps, TIRF a été employé pour vérifier les endroits de contact des cellules et des substrats des fibroblastes humains de peau, avec des études sur la dynamique extérieure biomédicale et le transfert d'énergie en cellules.

Les utilisations principales de la microscopie de TIRF sont liées à la membrane cellulaire, puisque c'est l'endroit qui est principalement imagé. En conséquence, la microscopie de TIRF peut être utilisée pour enregistrer le comportement de l'endocytose ligand-assistée de récepteur, ainsi que le mouvement transversal des récepteurs le long de la membrane. Les récepteurs sont en pareil cas habituellement imagés utilisant les ligands, les anticorps, ou les petites molécules fluorescent étiquetés.

La microscopie de TIRF a été également appliquée à l'exocytose et à l'endocytose d'étude. Des teintures fluorescentes ou les protéines peuvent être encastrées avec la cargaison d'une vésicule, permettant pour suivre le mouvement de la vésicule pendant l'exocytose.

La microscopie de TIRF a été assimilé appliquée à l'endocytose, où elle a aidé en définissant les rôles des protéines telles que Rab3A et Rab27A, prouvant que ces deux protéines règlent des opérations d'arrimage de la vésicule à la membrane d'une façon coopérative. On lui a également montré comment Rab3A dissociera d'une vésicule pendant l'exocytose.

L'excitation des fluorophores par l'intermédiaire de l'inducteur évanescent est hautement utile pour des cellules plus épaisses, telles que les cellules mammifères. Les cellules mammifères contiennent également les fluorophores naturels, tels que le flavin et le nadh. La partie mince réalisée par microscopie de TIRF s'assure que de tels fluorophores naturels ne sont pas sensiblement excités. Ceci aide à élever le rapport signal/bruit élevé.

Le sectionnement optique de ce genre effectue l'idéal de microscopie de TIRF pour des molécules et des caractéristiques de représentation à la surface adjacente entre la surface de cellules et le substrat, par exemple adhérences focales, vésicules sécrétoires, ainsi que premières particules endocytic.

TIRF peut-il être appliqué à la neurologie ?

La microscopie de TIRF est limitée aux structures et aux procédés de représentation se produisant ou près derrière la surface adjacente entre le spécimen et la lamelle. Cependant, il y a plusieurs applications importantes où les questions près de la surface de cellules ont besoin d'enquête complète, telle que des questions de neurologie.

Le desserrage et la prise des neurotransmetteurs aux synapses neuronales ont été précédemment étudiés par les voies qui peuvent être discutées pour être indirectes, comme des approches génétiques et à microscope électronique.

D'autre part, les offres de microscopie de TIRF dirigent la représentation visuelle des procédés dynamiques tels que les interactions de protéine et de vésicule dans des neurones. Par des exemples, les études ont conçu le desserrage des vésicules contenant des lipides des zones actives, et le transport des vésicules des nanomètres d'un gisement 20 de réserve à partir de la membrane de plasma pour remonter relâchés.

Utilisations et considérations de composé

En 2011, les élaborations ultérieures de cette méthode ont abouti à améliorer la représentation des caractéristiques plus profondes à l'intérieur de la cellule. Toute la réflexion interne qui produit de l'onde évanescente se produit habituellement à la surface adjacente entre l'échantillon et la lamelle en verre, mais la surface adjacente peut être plus profonde localisé dans l'échantillon.

La base de produire de l'onde évanescente est que deux surfaces (échantillon et glace) doivent avoir différents indices de réfraction. Si la surface adjacente entre les medias avec différents indices de réfraction se produit dans l'échantillon, la représentation peut être plus profonde fait dans la cellule. Par exemple, la membrane de plasma en cellules de centrale a été favorable à une telle représentation.

Des des autres un concept assimilé peuvent se produire qui est TIRF frustrés par ` appelé'. Dans lui, l'inducteur qui est produit à la surface adjacente entre la lamelle et l'échantillon propage la lumière à une deuxième surface adjacente. Cette surface adjacente est située dans l'inducteur évanescent.

Le TIRF frustrant peut être produit si les indices de réfraction dans un échantillon sont à une certaine valeur. Avec reconnaissance, TIRF frustrant peut être indiqué indépendamment de TIRF normal par cela que le faisceau réfléchi de la surface adjacente est sensiblement plus faible.

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Last Updated: Nov 27, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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