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Applicazioni totali di microscopia di fluorescenza (TIRF) del riflesso interno

La microscopia totale della fluorescenza del riflesso interno (abbreviata solitamente come TIRF) è un metodo della rappresentazione che illumina la fluorescenza in un'area bassa dell'esemplare per migliorare il rapporto segnale-rumore. Questa tecnica ampiamente si applica in piccole strutture o molecole della rappresentazione.

Cellule tumorali illuminate da microscopia di fluorescenza - da Caleb adottivo

Caleb adottivo | Shutterstock

Metodologia di microscopia di TIRF

Nella microscopia di TIRF, le molecole fluorescenti sono in un campione in un ambiente acquoso che è vicino ad un solido con un alto indice di rifrazione, solitamente una lamella di vetro. A che cosa è chiamato l'angolo critico, l'illuminazione completamente è riflessa fuori dall'interfaccia fra il vetro ed il liquido. Questo riflesso crea un campo elettromagnetico sottile chiamato l'onda evanescente.

L'onda evanescente ha eccitato i fluorophores all'interno di 100-200 nanometro della lamella di vetro. Questo campo sottile è importante per tre ragioni: il rapporto di segnale--sfondo è l'alta, fluorescenza pochissima che è sfuocato è raccolta ed infine, l'indicatore luminoso che le celle sono esposte a è sostanzialmente più di meno delle tecniche tradizionali di microscopia.

Applicazioni di base di microscopia di TIRF

La microscopia di TIRF inizialmente è stata sviluppata negli anni 80, ma non è stata usata molto fino ad oggi. Negli inizi, TIRF è stato usato per studiare le aree di contatto delle celle e dei substrati dei fibroblasti umani dell'interfaccia, con gli studi sul trasferimento di superficie biomedico di energia e di dinamica in celle.

Le utilizzazioni principali di microscopia di TIRF sono collegate con la membrana cellulare, poiché questa è l'area che è soprattutto imaged. Di conseguenza, la microscopia di TIRF può essere impiegata per registrare il comportamento del endocytosis legante-mediato del ricevitore come pure il movimento laterale dei ricevitori lungo la membrana. I ricevitori in tali casi sono solitamente imaged facendo uso dei leganti fluorescente etichettati, degli anticorpi, o di piccole molecole.

La microscopia di TIRF egualmente si è applicata ad esocitosi e al endocytosis di studio. Le tinture fluorescenti o le proteine possono essere incassate con il carico di una vescicola, permettente di tenere la carreggiata il movimento della vescicola durante l'esocitosi.

La microscopia di TIRF si è applicata similmente al endocytosis, dove ha aiutato nella definizione dei ruoli delle proteine quali Rab3A e Rab27A, indicante che quelle due proteine regolamentano i punti di aggancio della vescicola alla membrana in un modo cooperativo. Egualmente è stato indicato come Rab3A dissocerà da una vescicola durante l'esocitosi.

L'eccitazione dei fluorophores via il campo evanescente è altamente utile per le celle più spesse, quali le cellule di mammiferi. Le cellule di mammiferi egualmente contengono i fluorophores naturali, quali il flavin ed il NADH. La sezione sottile raggiunta da microscopia di TIRF assicura che tali fluorophores naturali non siano significativamente emozionanti. Ciò contribuisce ad elevare l'alto rapporto segnale-rumore.

La divisione ottica di questo genere fa l'ideale di microscopia di TIRF per le molecole e le funzionalità della rappresentazione all'interfaccia fra la superficie delle cellule ed il substrato, per esempio aderenze focali, vescicole secretive come pure particelle endocytic in anticipo.

Può TIRF applicarsi alla neuroscienza?

La microscopia di TIRF è limitata alle strutture ed ai trattamenti della rappresentazione che accadono a o vicino all'interfaccia fra l'esemplare e la lamella. Tuttavia, ci sono parecchie applicazioni importanti dove le domande vicino alla superficie delle cellule hanno bisogno della ricerca accurata, quali le domande della neuroscienza.

La versione e l'assorbimento dei neurotrasmettitori alle sinapsi di un neurone precedentemente sono stati studiati dai modi che possono essere discussi per essere indiretti, quali gli approcci genetici ed al microscopio elettronico.

D'altra parte, le offerte di microscopia di TIRF dirigono la rappresentazione visiva dei trattamenti dinamici quali le interazioni della vescicola e della proteina in neuroni. Per gli esempi, gli studi hanno preveduto la versione delle vescicole che contengono i lipidi dalle zone attive ed il trasporto delle vescicole dai nanometri di un raggruppamento 20 della riserva a partire dalla membrana di plasma per sostituire quei rilasciati.

Usi e considerazioni del complesso

Nel 2011, ulteriori elaborazioni di questo metodo piombo per migliorare la rappresentazione delle funzionalità più profonde dentro la cella. Il riflesso interno totale che genera l'onda evanescente si presenta solitamente all'interfaccia fra il campione e la lamella di vetro, ma l'interfaccia può essere più profondo individuato nel campione.

La base della generazione dell'onda evanescente è che due superfici (campione e vetro) devono avere indici di rifrazione differenti. Se l'interfaccia fra i media con indici di rifrazione differenti si presenta all'interno del campione, la rappresentazione può essere più profondo fatto nella cella. Per esempio, la membrana di plasma in cellule vegetali è stata favorevole a tale rappresentazione.

Un altro un simile concetto possono accadere che è chiamato TIRF frustrato `'. In, il campo che è creato all'interfaccia fra la lamella ed il campione propaga l'indicatore luminoso ad una seconda interfaccia. Questa interfaccia è situata all'interno del campo evanescente.

Il TIRF frustrato può essere creato se gli indici di rifrazione in un campione sono a certo valore. Riconoscente, TIRF frustrato può essere detto oltre a TIRF normale da quello che il raggio riflesso dall'interfaccia è significativamente più debole.

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Last Updated: Nov 27, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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