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Aplicações totais da microscopia de fluorescência (TIRF) da reflexão interna

A microscopia total da fluorescência da reflexão interna (abreviada geralmente como TIRF) é um método da imagem lactente que ilumine a fluorescência em uma área rasa do espécime a fim aumentar a relação de relação sinal-ruído. Esta técnica é aplicada extensamente em estruturas ou em moléculas pequenas da imagem lactente.

Células cancerosas iluminadas pela microscopia de fluorescência - por Caleb adoptivo

Caleb adoptivo | Shutterstock

Metodologia da microscopia de TIRF

Na microscopia de TIRF, as moléculas fluorescentes estão em uma amostra em um ambiente aquoso que esteja perto de um sólido com um R.I. alto, geralmente uma lamela de vidro. Em o que é chamado o ângulo crítico, a iluminação é reflectida totalmente fora da relação entre o vidro e o líquido. Esta reflexão cria um campo eletromagnético fino chamado a onda esvanecente.

Os fluorophores entusiasmado da onda esvanecente dentro de 100-200 nanômetro da lamela de vidro. Este campo fino é importante para três razões: a relação do sinal-à-fundo é a fluorescência alta, muito pequena que é fora de foco é recolhida, e última, a luz que as pilhas estão expor a é substancialmente menos do que técnicas tradicionais da microscopia.

Aplicações básicas da microscopia de TIRF

A microscopia de TIRF foi desenvolvida inicialmente nos anos 80, mas não foi usada muito até recentemente. Nos primeiros dias, TIRF foi usado para investigar as áreas de contacto das pilhas e das carcaças de fibroblasto humanos da pele, junto com estudos na dinâmica da superfície do biomedical e na transferência de energia nas pilhas.

As utilizações principais da microscopia de TIRF são relacionadas à membrana de pilha, desde que esta é a área que é primeiramente imaged. Conseqüentemente, a microscopia de TIRF pode ser empregada para gravar o comportamento do endocytosis ligante-negociado do receptor, assim como o movimento lateral dos receptors ao longo da membrana. Os receptors são nesses casos geralmente imaged usando ligantes fluorescente etiquetadas, anticorpos, ou moléculas pequenas.

A microscopia de TIRF foi aplicada igualmente ao exocytosis e ao endocytosis do estudo. As tinturas fluorescentes ou as proteínas podem ser encaixadas com a carga de uma vesícula, tornando a possível seguir o movimento da vesícula durante o exocytosis.

A microscopia de TIRF foi aplicada similarmente ao endocytosis, onde ajudou em definir os papéis das proteínas tais como Rab3A e Rab27A, mostrando que aquelas duas proteínas regulam etapas do embarcadouro da vesícula à membrana em uma maneira cooperativa. Igualmente mostrou-se como Rab3A se separará de uma vesícula durante o exocytosis.

A excitação dos fluorophores através do campo esvanecente é altamente útil para umas pilhas mais grossas, tais como pilhas mamíferas. As pilhas mamíferas igualmente contêm fluorophores naturais, tais como o flavin e o NADH. A secção fina conseguida pela microscopia de TIRF assegura-se de que tais fluorophores naturais não sejam significativamente entusiasmado. Isto ajuda a elevar a relação de relação sinal-ruído alta.

A secção óptica deste tipo faz o ideal da microscopia de TIRF para moléculas e características da imagem lactente na relação entre a superfície da pilha e a carcaça, por exemplo adesões focais, vesículas secretory, assim como partículas endocytic adiantadas.

Pode TIRF ser aplicado à neurociência?

A microscopia de TIRF é limitada às estruturas e aos processos da imagem lactente que acontecem ou perto da relação entre o espécime e a lamela. Contudo, há diversas aplicações importantes onde as perguntas perto da superfície da pilha precisam a investigação completa, tal como perguntas da neurociência.

A liberação e a tomada dos neurotransmissor em sinapses neuronal têm sido estudadas previamente pelas maneiras que podem ser argumentidas para ser indirectas, como genéticas e o elétron - aproximações microscópicas.

Por outro lado, as ofertas da microscopia de TIRF dirigem a imagem lactente visual de processos dinâmicos tais como as interacções da proteína e da vesícula nos neurônios. Para exemplos, os estudos visualizaram a liberação das vesículas que contêm lipidos das zonas activas, e o transporte das vesículas de uma associação da reserva 20 nanômetros longe da membrana de plasma para substituir liberados.

Usos e considerações do complexo

Em 2011, umas revelações mais adicionais deste método conduziram para melhorar a imagem lactente das características mais profundas dentro da pilha. A reflexão interna total que gera a onda esvanecente ocorre geralmente na relação entre a amostra e a lamela de vidro, mas a relação pode ser mais profunda encontrado na amostra.

A base de gerar a onda esvanecente é que duas superfícies (amostra e vidro) precisam de ter deslocamentos predeterminados refractive diferentes. Se a relação entre media com deslocamentos predeterminados refractive diferentes ocorre dentro da amostra, a imagem lactente pode ser mais profunda feito na pilha. Por exemplo, a membrana de plasma em pilhas da planta foi favorável a tal imagem lactente.

Outros um conceito similar podem ocorrer que seja chamado TIRF frustrado `'. Nele, o campo que é criado na relação entre a lamela e a amostra propaga a luz a uma segunda relação. Esta relação é ficada situada dentro do campo esvanecente.

O TIRF frustrante pode ser criado se os deslocamentos predeterminados refractive em uma amostra estão em algum valor. Grata, TIRF frustrante pode ser dito independentemente de TIRF normal por aquele que o feixe refletido da relação é significativamente mais fraco.

Fontes

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Last Updated: Nov 27, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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