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Usos totales de la microscopia de fluorescencia (TIRF) de la reflexión interna

La microscopia total de la fluorescencia de la reflexión interna (abreviada generalmente como TIRF) es un método de la proyección de imagen que ilumina fluorescencia en un área baja del espécimen para aumentar el ratio señal/ruido. Esta técnica se aplica extensamente en pequeñas estructuras o moléculas de la proyección de imagen.

Células cancerosas iluminadas por microscopia de fluorescencia - por Caleb adoptivo

Caleb adoptivo | Shutterstock

Metodología de la microscopia de TIRF

En microscopia de TIRF, las moléculas fluorescentes están en una muestra en un ambiente acuoso que esté cerca de un macizo con un alto índice de refracción, generalmente una tira de cristal. A qué se llama el ángulo crítico, la iluminación se refleja totalmente del interfaz entre el cristal y el líquido. Esta reflexión crea un campo electromagnético fino llamado la onda evanescente.

La onda evanescente excitó fluorophores dentro de 100-200 nanómetro de la tira de cristal. Este campo fino es importante por tres razones: la índice del señal-a-fondo es la fluorescencia alta, muy pequeña que está desenfocado cerco, y pasado, es la luz que las células están expuestas a substancialmente menos que técnicas tradicionales de la microscopia.

Usos básicos de la microscopia de TIRF

La microscopia de TIRF fue desarrollada inicialmente en los años 80, pero no se ha utilizado mucho hasta hace poco tiempo. En los primeros días, TIRF fue utilizado para investigar las áreas de contacto de células y de substratos de los fibroblastos humanos de la piel, junto con estudios en transferencia superficial biomédica de la dinámica y de energía en células.

Los usos principales de la microscopia de TIRF se relacionan con la membrana celular, puesto que ésta es el área que es sobre todo reflejada. Por lo tanto, la microscopia de TIRF se puede emplear para registrar el comportamiento del endocytosis ligand-mediado del receptor, así como el movimiento lateral de receptores a lo largo de la membrana. Los receptores en estos casos son generalmente reflejados usando ligands fluorescente marcados con etiqueta, anticuerpos, o pequeñas moléculas.

La microscopia de TIRF también se ha aplicado a la exocitosis y al endocytosis del estudio. Los tintes fluorescentes o las proteínas se pueden embutir con el cargamento de una vesícula, permitiendo rastrear el movimiento de la vesícula durante exocitosis.

La microscopia de TIRF se ha aplicado semejantemente al endocytosis, donde ha ayudado en la definición del papeles de proteínas tales como Rab3A y Rab27A, mostrando que esas dos proteínas regulan los pasos del muelle de la vesícula a la membrana de una manera cooperativa. También fue mostrado cómo Rab3A disociará de una vesícula durante exocitosis.

La excitación de fluorophores vía el campo evanescente es altamente útil para células más gruesas, tales como células mamíferas. Las células mamíferas también contienen fluorophores naturales, tales como flavin y NADH. La sección fina lograda por microscopia de TIRF se asegura de que tales fluorophores naturales no son importante emocionados. Esto ayuda a elevar el alto ratio señal/ruido.

El seccionamiento óptico de esta clase hace el ideal de la microscopia de TIRF para las moléculas y las características de la proyección de imagen en el interfaz entre la superficie y el substrato, por ejemplo adherencias focales, vesículas secretores, así como partículas endocytic tempranas de la célula.

¿Se puede TIRF aplicar a la neurología?

La microscopia de TIRF se limita a las estructuras y a los procesos de la proyección de imagen suceso en o cerca del interfaz entre el espécimen y la tira. Sin embargo, hay varios usos importantes donde las preguntas cerca de la superficie de la célula necesitan la investigación completa, tal como preguntas de la neurología.

La baja y la absorción de neurotransmisores en las sinapsis neuronales han sido estudiadas previamente por las maneras que se pueden discutir para ser indirectas, por ejemplo aproximaciones genéticas y de microscopio electrónico.

Por otra parte, las ofertas de la microscopia de TIRF dirigen la proyección de imagen visual de procesos dinámicos tales como las acciones recíprocas de la proteína y de la vesícula en neuronas. Por ejemplos, los estudios han visualizado la baja de las vesículas que contenían los lípidos de zonas activas, y el transporte de vesículas de un centro común de la reserva 20 nanómetros lejos de la membrana de plasma para reemplazar liberados.

Aplicaciones y consideraciones del complejo

En 2011, otros progresos de este método llevaron para mejorar la proyección de imagen de las características más profundas dentro de la célula. La reflexión interna total que genera la onda evanescente ocurre generalmente en el interfaz entre la muestra y la tira de cristal, pero el interfaz puede ser más profundo localizado en la muestra.

La base de generar la onda evanescente es que dos superficies (muestra y cristal) necesitan tener diversos índices refractivos. Si el interfaz entre los ambientes con diversos índices refractivos ocurre dentro de la muestra, la proyección de imagen puede ser más profunda hecho en la célula. Por ejemplo, la membrana de plasma en células de la instalación ha sido favorable a tal proyección de imagen.

Otros un concepto similar pueden ocurrir que se llame TIRF frustrado `'. En él, el campo que se crea en el interfaz entre la tira y la muestra propaga la luz a un segundo interfaz. Este interfaz está situado dentro del campo evanescente.

El TIRF frustrado puede ser creado si los índices refractivos en una muestra están en cierto valor. Agradecidamente, TIRF frustrado se puede informar aparte de TIRF normal por eso que el haz reflejado del interfaz es importante más débil.

Fuentes

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Last Updated: Nov 27, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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