Applications Transfert-ACP (tPCR)

Transfert-ACP se rapporte à une technique dans laquelle l'ACP amplifie l'objectif ADN et l'intègre dans un vecteur de destination dans un tube unique, sans nécessité d'épurer le produit intermédiaire d'ACP.

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Comment va-t-il le travail transfert-ACP (tPCR) ?

Méthodes précédentes de clonage d'ADN impliquées assimilant le vecteur et insérant l'ADN dans un objectif utilisant des enzymes de restriction, suivies de ligature. Cette méthode désigné sous le nom du clonage Ligature-Dépendant.

Par la suite, des méthodes qui ne comportent pas la ligature ont été développées ; désigné sous le nom du clonage Ligature-Indépendant (LIC). L'ACP de transfert est une forme de LIC où la manipulation d'ADN peut être exécutée d'une voie flexible, rapide, et économique.

Cette approche méthodologique combine fondamentalement les deux méthodes d'amplification d'ACP et d'intégration d'ADN dans le vecteur d'objectif, et enlève les opérations de la purification intermédiaire ou l'utilisation des nécessaires commerciaux.

Clonage d'ADN

Dans une validation de principe l'étude, les scientifiques avaient l'habitude deux gènes de différentes longueurs (1300bp et 500bp), ainsi qu'un plasmide de distributeur pour comporter le gène au vecteur d'expression. Les amorces choisies pour amplifier les séquences se sont échelonnées de 50-57 paires de bases, et ont eu une région superposante de 30bp avec le site qui a dû intégré dedans au vecteur réceptif.

L'amplification limitée du gène cible a été effectuée pour treize cycles, qui a été suivi de les vingt cycles suivants de l'amplification, et plus long temps d'allongement qui a comporté les méga-amorces dedans au vecteur réceptif.

Dans cette réaction, le rendement de l'ACP de transfert dépend grand de la concentration des amorces à mesure que le produit intermédiaire d'ACP produit augmentait avec l'augmentation de la concentration en amorce. La présence du gène désiré a été confirmée en effectuant l'ACP de colonie avec des amorces flanquant les sites d'intégration d'objectif.

Les auteurs de l'étude ont maintenant été couronnés de succès dans le clonage plus de 100 gènes dans plusieurs vecteurs d'expression utilisant l'ACP de transfert, s'avérant l'efficacité de cette méthode copier l'ADN.

mutagénèse dirigée visée parsite

L'ACP de transfert a été également employé pour exécuter la mutagénèse dirigée complexe d'ADN, y compris le rétablissement simultané des mutations visées par multiple aux sites spécifiques dans une séquence programmée de protéine. D'ailleurs, la méthode a été employée pour comporter des mutations multiples au gène de calmoduline (came) pour augmenter sa capacité de liaison vers la kinase Calcium-dépendante II ; cependant, le temps de processus a pris très longtemps.

Pour réduire le temps de construction, une variante de came avec neuf mutations peut être sélectée, et sept amorces comportant ces modifications ont été conçues par des chercheurs. Puis, l'ACP de transfert peut être effectué en ajoutant chacune des sept amorces simultanément dedans au mélange de la réaction.

La méthode de mutagénèse dirigée de multiple-site dépend également hautement de la concentration en amorce, où l'intensité de l'ACP a été augmentée en réponse à la concentration accrue en amorce. On a observé l'intensité la plus normale du plasmide synthétisé quand la concentration en amorce était de l'ordre de 10-20 nanomètres ; cependant, aux concentrations plus élevées ou inférieur cette gamme, il y avait une immersion dans le rendement.

Bibliothèques combinatoires des protéines

Pour expliquer cette application, un domaine bien-caractérisé de protéine G streptococcique a été choisi. L'objectif était de concevoir les associés grippants et inhibants de roman de Ras GTPase, un contact principal qui a réglé des voies concernées par la croissance des cellules et la différenciation. La construction d'une bibliothèque combinatoire des mutants de protéine G a été exécutée à l'aide de l'ACP de transfert.

On a utilisé trois amorces mutagéniques qui ont contenu les nucléotides spécifiques et dégénérés désirés à l'emplacement spécifique. Le rendement dépendait de la concentration de l'amorce, avec le rendement maximal actuel aux concentrations en amorce de 10-20 nanomètres.

Vingt-huit clones fait au hasard sélectés ont été ordonnancés et ont trouvé pour être seuls.  En outre, examiner des variantes multiples de la protéine de G a également indiqué la présence des séquences obligatoires de protéine nouvelle de G, apparence les avantages d'une telle méthode. En bref, l'adaptation de la méthode d'ACP de transfert a la propension de simplifier, accélérer et réduire le temps et coût pour une structure de grande sélection et des études fonctionnelles.

Last Updated: Jan 9, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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