Applicazioni Trasferimento-PCR (tPCR)

Trasferimento-PCR si riferisce ad una tecnica in cui la PCR amplia il DNA dell'obiettivo e lo integra in un vettore della destinazione in un singolo tubo, senza la necessità di depurare il prodotto intermedio di PCR.

Tubi di PCR - dalla foto di scienzafoto di scienza | Shutterstock

Come fa il lavoro trasferimento-PCR (tPCR)?

I metodi precedenti della clonazione del DNA hanno compreso digerire il vettore ed inserire il DNA in un obiettivo facendo uso degli enzimi della restrizione, seguiti dalla legatura. Questo metodo si riferisce a come clonazione Legatura-Dipendente.

Successivamente, i metodi che non comprendono la legatura sono stati messi a punto; riferito a come clonazione dell'Legatura-Indipendente (LIC). La PCR di trasferimento è un modulo di LIC dove la manipolazione del DNA può essere realizzata in un modo flessibile, veloce ed economico.

Questo approccio metodologico combina basicamente i due metodi di amplificazione di PCR e di integrazione del DNA nel vettore dell'obiettivo ed elimina i punti di depurazione intermedia o l'uso dei kit commerciali.

Clonazione del DNA

In uno studio del proof of concept, gli scienziati hanno usato due geni delle lunghezze differenti (1300bp e 500bp) come pure un plasmide erogatore per incorporare il gene nel vettore di espressione. Le mani di fondo scelte per ampliare le sequenze hanno variato da 50-57 coppie di basi ed hanno avute una regione di sovrapposizione di 30bp con il sito che ha dovuto integrato dentro al vettore ricevente.

L'amplificazione limitata del gene dell'obiettivo è stata eseguita per tredici cicli, che è stato seguito dall'venti cicli successivi dell'amplificazione e tempo maggiore dell'allungamento che ha incorporato le mega-mani di fondo dentro al vettore ricevente.

In questa reazione, il risparmio di temi della PCR di trasferimento dipende notevolmente dalla concentrazione di mani di fondo come il prodotto intermedio di PCR generato è aumentato con l'aumento di concentrazione nella mano di fondo. La presenza del gene desiderato è stata confermata eseguendo la PCR della colonia con le mani di fondo che fiancheggiano i siti di integrazione dell'obiettivo.

Gli autori dello studio ora sono riusciti nella clonazione oltre 100 geni in parecchi vettori di espressione facendo uso della PCR di trasferimento, rivelantesi l'efficacia di questo metodo clonare il DNA.

mutagenesi mirata a Multiplo-sito

La PCR di trasferimento egualmente è stata utilizzata per eseguire la mutagenesi complessa del DNA, compreso la generazione simultanea di mutazioni mirate a multiplo ai siti specifici in una sequenza codificante della proteina. Inoltre, il metodo è stato usato per comprendere le mutazioni multiple nel gene della calmodulina (camma) per aumentare la sua capacità obbligatoria verso la chinasi Calcio-dipendente II; tuttavia, il tempo trattato ha catturato molto lungamente.

Per diminuire il tempo di costruzione, una variante della camma con nove mutazioni può essere selezionata e sette mani di fondo che comprendono questi cambiamenti sono state progettate dai ricercatori. Poi, la PCR di trasferimento può essere eseguita aggiungendo tutte e sette le mani di fondo simultaneamente dentro alla miscela di reazione.

Il metodo di mutagenesi del multiplo-sito dipende egualmente altamente da concentrazione nella mano di fondo, dove l'intensità della PCR è stata aumentata in risposta a concentrazione aumentata nella mano di fondo. Il più alta intensità del plasmide sintetizzato è stata osservata quando la concentrazione nella mano di fondo era nell'ordine di 10-20 nanometri; tuttavia, alle concentrazioni più alte o inferiore a questo intervallo, c'era una immersione nel risparmio di temi.

Librerie combinatorie delle proteine

Per dimostrare questa applicazione, un dominio ben-caratterizzato di proteina streptococcica G è stato scelto. Lo scopo era di progettare i partner novelli di inibizione e dell'associazione di Ras GTPase, un interruttore generale che ha regolamentato le vie responsabili della crescita e della differenziazione delle cellule. La costruzione di una libreria combinatoria dei mutanti di G della proteina è stata realizzata usando la PCR di trasferimento.

Tre mani di fondo mutagene sono state utilizzate che hanno contenuto i nucleotidi specifici e degenerati desiderati alle posizioni specifiche. Il risparmio di temi dipendeva dalla concentrazione di mano di fondo, con risparmio di temi di punta presente alle concentrazioni nella mano di fondo di 10-20 nanometri.

Ventotto cloni a caso selezionati sono stati ordinati e trovato per essere unici.  Inoltre, la schermatura delle varianti multiple della proteina di G egualmente ha rivelato la presenza di sequenze obbligatorie della proteina novella di G, rappresentazione i vantaggi di un tal metodo. In breve, l'adattamento del metodo di PCR di trasferimento ha la tendenza a semplificare, accelerare e diminuire il tempo ed i costi per una struttura di grande selezione e gli studi funzionali.

Sorgenti

[ulteriore lettura: Reazione a catena della polimerasi]

Last Updated: Jan 9, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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