(TPCR) aplicações Transferência-PCR

O Transferência-PCR refere uma técnica em que o PCR amplifica o ADN do alvo e o integra em um vector do destino em uma única câmara de ar, sem a necessidade de refinar o produto intermediário do PCR.

Câmaras de ar do PCR - pela foto da ciênciafoto da ciência | Shutterstock

Como faz (tPCR) o trabalho transferência-PCR?

Os métodos precedentes da clonagem do ADN envolveram digerir o vector e introduzir o ADN em um alvo usando as enzimas da limitação, seguidas pela ligadura. Este método é referido como a clonagem Ligadura-Dependente.

Subseqüentemente, os métodos que não envolvem a ligadura foram desenvolvidos; referido como a clonagem Ligadura-Independente (LIC). O PCR de transferência é um formulário de LIC onde a manipulação do ADN pode ser executada em uma maneira flexível, rápida, e econômica.

Esta abordagem metodológica combina basicamente os dois métodos da amplificação do PCR e da integração do ADN no vector do alvo, e remove as etapas da purificação intermediária ou o uso de jogos comerciais.

Clonagem do ADN

Em uma prova do estudo do conceito, os cientistas usaram dois genes de comprimentos diferentes (1300bp e 500bp), assim como um plasmídeo fornecedor para incorporar o gene no vector da expressão. As primeiras demão escolhidas amplificar as seqüências variaram de 50-57 pares baixos, e tiveram uma região de sobreposição de 30bp com o local que teve que integrado dentro ao vector destinatário.

A amplificação limitada do gene do alvo foi executada por treze ciclos, que foi seguido pelo vinte ciclos subseqüentes da amplificação, e um tempo mais longo do alongamento que incorporasse as mega-primeiras demão dentro ao vector destinatário.

Nesta reacção, a eficiência do PCR de transferência é extremamente dependente da concentração de primeiras demão como o produto intermediário do PCR gerado aumentou com concentração crescente da primeira demão. A presença do gene desejado foi confirmada executando o PCR da colônia com as primeiras demão que flanqueiam os locais da integração do alvo.

Os autores do estudo têm sido agora bem sucedidos na clonagem sobre 100 genes em diversos vectores da expressão usando o PCR de transferência, provando a eficácia deste método clonar o ADN.

mutagênese visada Múltiplo-local

O PCR de transferência foi usado igualmente para executar a mutagênese complexa do ADN, incluindo a geração simultânea de mutações visadas múltiplo em locais específicos em uma seqüência de codificação da proteína. Além disso, o método foi usado para incorporar mutações múltiplas no gene do calmodulin (came) para aumentar sua capacidade de ligação para a quinase Cálcio-dependente II; contudo, o tempo do processo tomou muito por muito tempo.

Para reduzir o tempo de construção, uma variação da came com nove mutações pode ser seleccionada, e sete primeiras demão que incorporam estas mudanças foram projectadas por pesquisadores. Então, o PCR de transferência pode ser executado adicionando todas as sete primeiras demão simultaneamente dentro à mistura de reacção.

O método da mutagênese do múltiplo-local é igualmente altamente dependente da concentração da primeira demão, onde a intensidade do PCR foi aumentada em resposta à concentração aumentada da primeira demão. A intensidade a mais alta do plasmídeo sintetizado foi observada quando a concentração da primeira demão estava na escala de 10-20 nanômetros; contudo, nas concentrações mais altas ou abaixe do que esta escala, havia um mergulho na eficiência.

Bibliotecas combinatórias das proteínas

Para demonstrar esta aplicação, um domínio bem-caracterizado da proteína streptococcal G foi escolhido. O alvo era projectar sócios obrigatórios e de inibições da novela de Ras GTPase, um interruptor mestre que regulasse os caminhos estados relacionados com o crescimento e a diferenciação da pilha. A construção de uma biblioteca combinatória de mutantes de G da proteína foi executada usando o PCR de transferência.

Três primeiras demão mutagénicas foram usadas que contiveram os nucleotides específicos e degenerate desejados em lugar específicos. A eficiência era dependente da concentração de primeira demão, com a eficiência máxima actual em concentrações da primeira demão de 10-20 nanômetros.

Vinte e oito clone aleatòria selecionados foram arranjados em seqüência e encontraram para ser originais.  Também, o exame das variações múltiplas da proteína de G igualmente revelou a presença de seqüências obrigatórias da proteína nova de G, exibição as vantagens de tal método. Em curto, a adaptação do método do PCR de transferência tem a propensão simplificar, expedir e reduzir a hora e os custos para uma estrutura do vasto leque e uns estudos funcionais.

Fontes

Last Updated: Jan 9, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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