Usos Transferencia-POLIMERIZACIÓN EN CADENA (tPCR)

Transferencia-POLIMERIZACIÓN EN CADENA refiere a una técnica en la cual la polimerización en cadena amplifique la DNA del objetivo y la integre en un vector del destino en un único tubo, sin la necesidad de purificar el producto intermedio de la polimerización en cadena.

Tubos de la polimerización en cadena - por la foto de la cienciafoto de la ciencia | Shutterstock

¿Cómo hace el trabajo transferencia-POLIMERIZACIÓN EN CADENA (tPCR)?

Los métodos anteriores de la reproducción de la DNA implicaron el digerir del vector y el insertar de la DNA en un objetivo usando las enzimas de la restricción, seguidas por la ligadura. Este método se refiere como reproducción Ligadura-Relacionada.

Posteriormente, los métodos que no implican la ligadura fueron desarrollados; designado la reproducción de la Ligadura-Independiente (LIC). La polimerización en cadena de la transferencia es una forma de LIC donde la manipulación de la DNA se puede realizar en una manera flexible, rápida, y económica.

Esta aproximación metodológica combina básicamente los dos métodos de amplificación de la polimerización en cadena y de integración de la DNA en el vector del objetivo, y quita los pasos de la purificación intermedia o el uso de estuches comerciales.

Reproducción de la DNA

En una prueba del estudio del concepto, los científicos utilizaron dos genes de diversos largos (1300bp y 500bp), así como un plásmido dispensador de aceite para incorporar el gen en el vector de la expresión. Las pinturas de fondo elegidas para amplificar las series colocaron a partir de 50-57 pares bajos, y tenían una región que recubría de 30bp con el sitio que tuvo que integrado hacia adentro al vector receptor.

La amplificación limitada del gen del objetivo fue realizada por trece ciclos, que fue seguido por los veinte ciclos subsiguientes de la amplificación, y un tiempo más largo de la elongación que incorporó las mega-pinturas de fondo hacia adentro al vector receptor.

En esta reacción, la eficiencia de la polimerización en cadena de la transferencia es grandemente relacionada en la concentración de pinturas de fondo como el producto intermedio de la polimerización en cadena generado aumentó con el aumento de la concentración de la pintura de fondo. La presencia del gen deseado fue confirmada realizando la polimerización en cadena de la colonia con las pinturas de fondo que flanqueaban los sitios de la integración del objetivo.

Los autores del estudio han sido acertados ahora en la reproducción sobre 100 genes en varios vectores de la expresión usando la polimerización en cadena de la transferencia, demostrando la eficacia de este método reproducir la DNA.

mutagénesis apuntada Múltiple-sitio

La polimerización en cadena de la transferencia también se ha utilizado para realizar mutagénesis compleja de la DNA, incluyendo la generación simultánea de mutaciones apuntadas múltiplo en los sitios específicos en una serie de codificación de la proteína. Por otra parte, el método se ha utilizado para incorporar mutaciones múltiples en el gen de la calmodulina (elevador) para aumentar su capacidad de enlace hacia la cinasa Calcio-relacionada II; sin embargo, el tiempo de proceso duró muy.

Para reducir el tiempo de construcción, una variante del elevador con nueve mutaciones puede ser seleccionada, y siete pinturas de fondo que incorporaban estos cambios han sido diseñadas por los investigadores. Entonces, la polimerización en cadena de la transferencia puede ser realizada agregando las siete pinturas de fondo simultáneamente hacia adentro a la mezcla de reacción.

El método de mutagénesis del múltiple-sitio es también altamente relacionado en la concentración de la pintura de fondo, donde la intensidad de la polimerización en cadena fue aumentada en respuesta a la concentración creciente de la pintura de fondo. La intensidad más alta del plásmido sintetizado fue observada cuando la concentración de la pintura de fondo estaba en el rango de 10-20 nanómetros; sin embargo, en las concentraciones más altas o baje que este alcance, había un declive en la eficiencia.

Bibliotecas combinatorias de proteínas

Para demostrar este uso, un dominio bien-caracterizado de la proteína estreptocócica G fue elegido. El objetivo era diseñar a socios obligatorios y de inhibiciones de la novela de Ras GTPase, un interruptor principal que reguló los caminos referidos a incremento y a la diferenciación de la célula. La construcción de una biblioteca combinatoria de los mutantes de G de la proteína fue realizada usando la polimerización en cadena de la transferencia.

Tres pinturas de fondo mutágenas fueron utilizadas que contuvieron los nucleótidos específicos y degenerados deseados en las situaciones específicas. La eficiencia era relacionada en la concentración de pintura de fondo, con la eficiencia máxima presente en las concentraciones de la pintura de fondo de 10-20 nanómetros.

Veintiocho copias aleatoriamente seleccionadas fueron ordenadas y encontraron para ser únicas.  También, el blindaje de las variantes múltiples de la proteína de G también reveló la presencia de series obligatorias de la proteína nueva de G, demostración las ventajas de tal método. En fin, la adaptación del método de la polimerización en cadena de la transferencia tiene la propensión a simplificar, a acelerar y a reducir hora y los costos para una estructura de la amplia gama y los estudios funcionales.

Fuentes

Last Updated: Jan 9, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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