Analisi di formazione della metropolitana: un'introduzione

L'angiogenesi, che denota il trattamento di sviluppare i nuovi vasi sanguigni da quei di preesistenza, è un evento vitale per lo sviluppo embrionale, la crescita dell'organo e ferisce la guarigione. I vasi sanguigni di recente creazione sono responsabili del fornitura l'ossigeno e delle sostanze nutrienti ai tessuti differenti, dell'eliminazione dei residui e della promozione della sorveglianza immune.

Fra le prove in vitro più specifiche e più ben definite per l'angiogenesi è la valutazione della tendenza delle celle endoteliali a formare le strutture 3D (anche conosciute come formazione del tubo). Indipendentemente dalla loro origine, le celle endoteliali sembrano capaci di formare spontaneamente i tubuli, se sono provvedute di tempo sufficiente in vitro per indicare le componenti extracellulari adeguate della matrice.

Principi dell'analisi di formazione del tubo

L'analisi di formazione del tubo rappresenta un metodo semplice, rapido e quantitativo per la determinazione dei geni o delle vie differenti che svolgono un ruolo nell'angiogenesi. Inizialmente descritto nel 1988, il principio fondamentale di questa analisi è che le celle endoteliali conservano la capacità per dividersi e migrare rapido in risposta a determinati segnali angiogenici.

Dopo la scoperta quel Matrigel (che è di un prodotto ricco di matrice derivato dalle celle del tumore dello Engelbreth-Holm-Sciame con laminin come componente primaria) può suscitare la formazione di tubo endoteliale delle cellule in 24 ore, queste analisi ha raggiunto un posto considerevole nel nostro repertorio della misura di angiogenesi.

La coltura delle celle endoteliali su un gel dell'estratto della membrana basale (BME) è un modo indurre la loro differenziazione e formazione del tipo di metropolitana delle strutture. I tubi che si sviluppano contengono un lumen circondati dalle celle endoteliali che si uniscono via i complessi giunzionali. Secondo la quantità ed il tipo di stimoli, la formazione del tubo può accadere rapidamente in questa analisi, con la maggior parte dei tubi che mostrano in 2 - 6 ore.

I tipi differenti di celle endoteliali possono essere utilizzati allo scopo di questa analisi - compreso sia le linee cellulari primarie che immortalate. Secondo la scelta, una linea cellulare è usata e l'uso delle celle endoteliali trasformate o non trasformate, l'ottimizzazione è spesso necessario identificare il tempo richiesto ideale per formazione adeguata del tubo.

Ottenere i risultati rappresentativi

La scelta di giusto tipo delle cellule per l'analisi di formazione del tubo è chiave per ottenere i risultati affidabili. Le celle endoteliali umane del filone ombelicale (HUVEC) e le celle endoteliali aortiche umane (HAEC) sono celle standardizzate che sono disponibili dalla società termo Fisher scientifico. Alcune linee cellulari del tumore (quali cancro al seno MDA-MB-435 o le celle del melanoma B16F1) possono egualmente formare i tubuli vascolari.

Il rivestimento della matrice di Matrigel dovrebbe essere ottimizzato tramite il processo di fabbricazione per generare la superficie piana ed eliminare il menisco. Tale Matrigel è disponibile dalle scienze biologiche del BD, che egualmente è schermato affinchè la sua capacità promuova la formazione efficiente del tubo.

Il conteggio delle cellule ha un impatto sostanziale su formazione del tubo, come con più celle la rete del tubo che può essere ottenuta diventa più estesa. Tuttavia, la densità di semina delle cellule dovrebbe anche essere considerata, perché l'alta concentrazione può provocare l'agglutinamento delle cellule o la formazione dello strato monomolecolare, così tutte le variazioni fra i gruppi del trattamento possono essere mascherate. La densità di semina ottimale è circa 5 mila celle per cm2.

I sistemi di conseguenza standardizzati possono aiutare significativamente nell'ottenere i migliori risultati. Per esempio, il kit di formazione della metropolitana del sistema GH di angiogenesi di Cultrex, disponibile da AMSBIO, permette la rilevazione facile sia degli induttori che degli inibitori di formazione del tubo delle cellule ed egualmente è adatte a 96 analisi buone di formato.

Le immagini possono essere documentate via microscopia di contrasto di fase impiegando gli obiettivi fra un ingrandimento di 4 e 20 volte. Tuttavia, se le immagini fluorescenti sono richieste, una calceina cella-permeant della tintura può aggiungersi e la rete endoteliale del tubo essere visualizzata usando fluorescenza o microscopia confocale. Tali celle macchiate di HUVEC possono anche essere individuate facendo uso della rappresentazione crollata confocale della pila disponibile dalle scienze biologiche del BD.

In conclusione, i vantaggi dell'analisi di formazione del tubo sono periodo facile e breve della cultura come pure possibilità di analisi di alto-capacità di lavorazione e di quantificazione. D'altra parte, lo svantaggio principale è una grande variazione di abilità diformazione fra i vari lotti delle celle endoteliali e delle matrici. Per concludere, tutti i risultati dovrebbero essere confermati in vivo.

Sorgenti

  1. http://www.clinchem.org/content/49/1/32.full
  2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4540586/
  3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3230200/
  4. http://www.amsbio.com/presentation/CAS_Tube_Formation_Assay.pdf
  5. http://www.bdbiosciences.com/documents/webinar_2010_05_angiogenesis.pdf
  6. https://www.thermofisher.com/hr/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/angiogenesis-protocols/endothelial-cell-tube-formation-assay.html

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Last Updated: Aug 23, 2018

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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    Meštrović, Tomislav. (2018, August 23). Analisi di formazione della metropolitana: un'introduzione. News-Medical. Retrieved on August 17, 2019 from https://www.news-medical.net/life-sciences/Tube-Formation-Assay-an-Introduction.aspx.

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Comments

  1. Lie Sian Yap Lie Sian Yap Taiwan says:

    Dear Dr. Tomislav Meštrović,

    I want to know why the formation of endothelial cell tube within 24 hours, and after 24 hours the tube started to decrease?  Thank you

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News-Medical.Net.
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