Ensaio da formação da câmara de ar: uma introdução

A angiogênese, que denota o processo de desenvolver vasos sanguíneos novos dos preexistências, é um evento vital para a revelação embrionária, o crescimento do órgão e a cura esbaforido. Os vasos sanguíneos recém-criados são responsáveis para fornecer o oxigênio e os nutrientes aos tecidos diferentes, remover os restos da produção e promover a fiscalização imune.

Entre o mais específico e bem definido testa in vitro para a angiogênese é a avaliação da propensão de pilhas endothelial formar as estruturas 3D (igualmente conhecidas como a formação da câmara de ar). Apesar de sua origem, as pilhas endothelial parecem capazes de formar espontâneamente tubules, se são fornecidas com o tempo suficiente in vitro estabelecer componentes extracelulares adequados da matriz.

Princípios do ensaio da formação da câmara de ar

O ensaio da formação da câmara de ar representa um método simples, rápido e quantitativo para a determinação dos genes ou dos caminhos diferentes que jogam um papel na angiogênese. Descrito inicialmente em 1988, o princípio fundamental deste ensaio é que as pilhas endothelial preservam a capacidade para se dividir e migrar ràpida em resposta a determinados sinais angiogenic.

Após a descoberta esse Matrigel (que é um produto matriz-rico derivado das pilhas do tumor do Engelbreth-Ilha-Enxame com laminin como um componente preliminar) pode induzir a formação de câmara de ar endothelial da pilha dentro de 24 horas, estes ensaios alcançou um lugar notável em nosso repertório da medida da angiogênese.

Cultivar pilhas endothelial em um gel do extracto da membrana do porão (BME) é uma maneira de induzir sua diferenciação e câmara de ar-como a formação das estruturas. As câmaras de ar que se tornam contêm um lúmen cercadas pelas pilhas endothelial que são juntadas junto através dos complexos conectivos. Segundo a quantidade e o tipo de estímulos, a formação da câmara de ar pode ocorrer rapidamente neste ensaio, com a maioria de câmaras de ar que mostram dentro de 2 a 6 horas.

Os tipos diferentes de pilhas endothelial podem ser utilizados para fins deste ensaio - incluir linha celular preliminares e imortalizadas. Segundo a escolha, uma linha celular é usada e o uso de pilhas endothelial transformadas ou não-transformadas, optimização é frequentemente necessário identificar o tempo ideal exigido para a formação adequada da câmara de ar.

Obtendo resultados representativos

A escolha de um tipo direito da pilha para o ensaio da formação da câmara de ar é giratória para obter resultados seguros. As pilhas endothelial humanas da veia de cordão umbilical (HUVEC) e as pilhas endothelial aórticas humanas (HAEC) são as pilhas estandardizadas que estão disponíveis da empresa Fisher Thermo científico. Algumas linha celular do tumor (tais como o cancro da mama MDA-MB-435 ou as pilhas da melanoma B16F1) podem igualmente formar tubules vasculares.

O revestimento da matriz de Matrigel deve ser aperfeiçoado pelo processo de manufactura a fim gerar uma superfície plana e eliminar o menisco. Tal Matrigel está disponível das ciências biológicas do BD, que é seleccionado igualmente para que sua capacidade promova a formação eficiente da câmara de ar.

A contagem de pilha tem um impacto substancial na formação da câmara de ar, como com mais pilhas a rede da câmara de ar que pode ser obtida se torna mais extensiva. Contudo, a densidade de semeação da pilha deve igualmente ser levada em consideração, porque a concentração alta pode conduzir à aglutinação da pilha ou à formação do monolayer, assim todas as variações entre grupos do tratamento podem tornar-se mascaradas. A densidade de semeação óptima é aproximadamente 5 mil pilhas por cm2.

Os sistemas conseqüentemente estandardizados podem significativamente ajudar em obter os melhores resultados. Por exemplo, o jogo da formação da câmara de ar do sistema GH da angiogênese de Cultrex, disponível de AMSBIO, permite a detecção fácil de indutor e de inibidores da formação da câmara de ar da pilha, e igualmente sere 96 ensaios bons do formato.

As imagens podem ser documentadas através da microscopia do contraste da fase empregando objetivos entre uma ampliação de 4 e 20 vezes. Não obstante, se as imagens fluorescentes são exigidas, um calcein pilha-permeant AM da tintura pode ser adicionado e a rede endothelial da câmara de ar ser visualizado usando a fluorescência ou a microscopia confocal. Tais pilhas manchadas de HUVEC podem igualmente ser detectadas usar a imagem lactente desmoronada confocal da pilha disponível das ciências biológicas do BD.

Em conclusão, as vantagens do ensaio da formação da câmara de ar são período fácil e curto da cultura, assim como possibilidade de análise da quantificação e da alto-produção. Por outro lado, a desvantagem principal é uma grande variação da capacidade deformação entre vários lotes de pilhas e de matrizes endothelial. Finalmente, todos os resultados devem ser confirmados in vivo.

Fontes

  1. http://www.clinchem.org/content/49/1/32.full
  2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4540586/
  3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3230200/
  4. http://www.amsbio.com/presentation/CAS_Tube_Formation_Assay.pdf
  5. http://www.bdbiosciences.com/documents/webinar_2010_05_angiogenesis.pdf
  6. https://www.thermofisher.com/hr/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/angiogenesis-protocols/endothelial-cell-tube-formation-assay.html

[Leitura adicional: Angiogênese]

Last Updated: Aug 23, 2018

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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Comments

  1. Lie Sian Yap Lie Sian Yap Taiwan says:

    Dear Dr. Tomislav Meštrović,

    I want to know why the formation of endothelial cell tube within 24 hours, and after 24 hours the tube started to decrease?  Thank you

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News-Medical.Net.
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